2. 仪器与材料

2.1 仪器

Agilent7890A-5975C气相色谱—质谱联用仪,配备DB-17毛细管柱(60m×0.25mm×0.25um);电子分析天平(BS224 S,北京赛多利斯仪器系统有限公司);RE-52B旋转蒸发器(RE-3000,上海亚荣生化仪器厂);循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240A型,上海精宏实验设备有限公司);水浴锅(江苏金坛市亿通电子有限公司)。

2.2 试剂与试药

三氟乙酸(TFA,化学纯,上海强顺化学试剂有限公司);盐酸羟胺(AR分析纯,宜兴市亚盛化工厂);吡啶(AR分析纯,中国医药(集团)上海化学试剂公司);甲醇(AR分析纯,南京化学试剂有限公司);乙酸酐(AR分析纯,无锡县化学试剂厂);三氯甲烷(AR分析纯,南京化学试剂有限公司)。

2.3 原料

小麦麸皮多糖(淮麦 33),L-鼠李糖(中国药品生物制品检定所),D-阿拉伯糖(中国药品生物制品检定所),D-木糖(上海试剂工厂),D-甘露糖(中国药品生物制品检定所),D-葡萄糖(中国药品生物制品检定所),D-半乳糖(中国药品生物制品检定所)。

3.实验方法与结果

3.1 多糖的水解:

取40mg多糖样品,放入10ml旋转蒸发瓶,加入4mol/L的三氟乙酸(TFA)4ml,封口,在110℃条件下水解6h,水解完毕后,冷却,40℃减压旋转蒸发浓缩至干,再加甲醇浓缩至干,重复操作3-4次以除尽TFA[9, 10]。

3.2 单糖对照品的衍生化

制备单糖衍生化对照品,其反应原理是:糖和盐酸羟胺在吡啶中加热反应生成糖肟,再加入醋酸酐作为乙酰化试剂,在加热条件下继续反应,则会生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物[11]。分别精密称取L-鼠李糖,D-阿拉伯糖,D-木糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,D-半乳糖[12]各10mg于安瓿瓶中,加入12mg盐酸羟胺,再加入0.6mL吡啶,封口,于90℃下恒温水浴30min,并不时振荡,取出冷却至室温;后加入0.6mL乙酸酐,封口,于90℃恒温水浴30min,并不时振荡,冷却至室温;于50℃减压旋转蒸干[13];再加入4mL三氯甲烷溶解,4000r/min离心5min,取上清液,过0.22m微孔滤膜,备用[14]。留待GC-MS分析产物。 

3.3 样品单糖乙酰化衍生物的制备

在水解样品中加入12mg盐酸羟胺,再加入0.6mL吡啶,封口。将上述备用样品按照3.2方法进行衍生化,留待GC-MS分析产物。在衍生物制备时要求样品干燥且需防止水分的进入。所以,多糖样品水解后必须进行干燥才能进行衍生反应。同时随着水解、干燥、有机溶剂再溶解等操作环节的增加,会使样品中的一些微量组分损失,从而导致不检出或测量误差[15]。

3.4 气相-质谱联用法分析单糖组成

3.4.1 气相-质谱分析条件

气相色谱条件: HP -5 MS 毛细管色谱柱(Agilent 30 mm × 0.32 mm i. d, 0.25 μm),检测器温度 230 °C, 进样口温度250 °C, 程序升温:初始温度 80 °C, 以 15 °C·min-1 升至 170 °C, 保持 4  min, 以 2.5 °C·min-1 升至 200 °C,以 20 °C·min-1 升至 250 °C, 保持 6.5  min。载气为高纯度氦气(99. 999 %), 柱前压 7.65 psi,进样量0.5 μl, 分流比 20∶ 1; 载气流速 1.0 ml·min-1[16] 。

质谱条件:离子源为 EI 源;离子源温度 250 °C; 电子能量 70 eV;四极杆温度150 °C;发射电流 34.6 μA, 质量范围 50 ~600 amu;溶剂延迟 5 min。

出峰结果不理想,峰形过于紧密,分离度不理想。

3.4.2气相-质谱分析条件优化

气相色谱条件:HP-5MS毛细管色谱柱(Agilent30 mm × 0.32mmi.d,0.25 μm),检测器温度280 °C,进样口温度250 °C,程序升温:初始温度80 °C,以20 °C •min-1升至170 °C,保持2 min,以2.5 °C •min-1升至240 °C,以10 °C •min-1升至280 °C,保持7 min。载气为高纯度氦气(99.999 %),柱前压7.65 psi,进样量0.5L,分流比20∶1,载气流速1.0 ml•min-1。

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