蒸馏水                          1000 ml

配制方法：将上述各成分加入蒸馏水中，加热溶解，补足蒸馏水至1000 ml，分装后，121℃灭菌20 min。

用无菌接种环挑取已出现“生花”现象的腌制蔬菜菜水表面的白色物质作为实验样品，将白色物质划线接种于营养琼脂培养基上并编号标记，每个编号的样品接种2个平行样，倒置于37℃恒温培养箱中培养1～2 d，观察并记录菌落的生长状况。对“生花”疑似菌分别编号，再将“生花”疑似菌的单菌落接种于营养琼脂培养基上，每个编号的单菌落接种2个平板，37℃恒温培养1～2 d，挑取单菌落，重复上述划线操作1～2次，直至获得纯培养物。

1。2。2“生花”细菌性微生物回接[5]

为观察分离得到的菌株是否能够引起腌制蔬菜产生“生花”现象，将分离得到的“生花”疑似菌分别接种到自然发酵的黄瓜中，以不接种的黄瓜作为空白对照，接种“生花”疑似菌株后出现“生花”现象的，将该“生花”细菌用于后续的鉴定。具体步骤如下：新鲜黄瓜清洗晾干后，切取50 g装入预先装有50 mL 盐水（浓度为10 %）的锥形瓶中，然后接种1～2环分离得到的“生花”疑似菌菌株，封口置于室温下培养发酵7 d，每天观察并记录黄瓜的发酵状况。

图 1 置于室温下发酵的黄瓜

Fig 1 In fermentation of cucumber at room temperature

1。2。3 “生花”细菌微生物的观察

形态学观察是指利用显微镜对被染色的微生物形状、大小、排列方式、细胞结构及染色特性进行镜下直接观察。不同微生物在相同的培养基中形成的菌落特征有很大的差异，而在一定的条件下，同一种微生物的培养特征具有一定的稳定性，因此，形态学上的差异性可以成为鉴别不同微生物的依据。

将分离得到的“生花”细菌微生物制作成水浸片，进行镜检。具体步骤如下：取一片洁净的载玻片，滴一滴无菌水于载玻片上，用接种环挑取少许“生花”细菌性微生物置于无菌水中，涂抹均匀，另取一片洁净盖玻片，呈45°覆盖菌液，置于光学显微镜下观察，先使用低倍镜观察，后使用高倍镜观察细胞形状、大小及繁殖方式。对“生花”细菌性微生物进行革兰氏染色，具体操作如下：涂片→干燥→固定→结晶紫染色1～2 min→水洗→卢戈氏碘液染色1 min→水洗→95%乙醇脱色20～30 s→立即水洗→番红复染2～3 min→水洗→干燥→镜检→低倍镜→高倍镜→油镜。文献综述

1。2。4  DNA简单提取方法

采用SDS法提取“生花”细菌性微生物总DNA，提取方法为：用灭菌的牙签将少量在营养琼脂平板上培养18 h的菌落挑入装有 20 μL 0。2%SDS的离心管中，在涡旋振荡仪上使菌体充分分散，将离心管放入沸水煮沸5 min，立即放入-20℃冰箱冷冻15 min，将样品10000 r/min离心1 min，取上清液用于PCR 扩增[6]。

1。2。5  PCR扩增和检测

通过PCR和DNA测序明确“生花”细菌16SrDNA的基因序列。细菌16SrDNA扩增引物为1492R和27F[7]，引物序列如表1所示。

表1 菌种鉴定引物

Table 1 Primers of species identification

             引物名称                       序列（5'→3'）                             退火温度（℃）