3。1 pEASYsUps45的构建 14

3。2 pEASYsUps45H的构建 15

3。3 sUps45-AH aroA-His序列的获得 15

3。4 pMGS36H-aroA的构建 16

4。 讨论 16

参考文献 17

致谢 18

1。引言

甲鱼，即中华鳖(Pelodiscus sinensis)，属于爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trlonychidae)、鳖属(Trionyx)，具有较高的食用和药用价值，是我国重要的淡水养殖名优品种。甲鱼养殖一直是增加农民收入、发展农村经济的有效途径，该养殖产业已成为许多省市的重点扶持产业和发展方向。但是在甲鱼养殖过程中由于商品鳖交易频繁、人工养殖密度过大和养殖环境污染等因素，各类病害在养殖群体中频繁爆发。目前的文献记载显示，甲鱼疾病种类已经达到了30余种[1]。在现如今的水产养殖业中，高密度和加温(一般28～30 oC)的饲养条件能加强水体中的常在菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)[2]的繁殖能力，并极易使其达到最佳状态，从而增强了致病性。故其是导致甲鱼生病的主要致病菌[3]。嗜水气单胞菌侵染甲鱼的临床表现病型有许多种，如因局部感染为主而导致的甲鱼体皮肤溃疡、疖疮等，或是出现了以腹底板瓷白色为特征的白底。除去这些症状，更多见且危害又最为严重的是甲鱼的急性出血性败血症[4~5]。论文网

当下，人们为了预防嗜水气单胞菌对养殖甲鱼过程中引起的感染，已有相当一部分研究报道了福尔马林活疫苗，亚单位疫苗和免疫佐剂等等。在这些疫苗中，口服疫苗是一个较为理想的疫苗载体。在这其中，因为食品级的乳酸菌疫苗载体方便实用，所以更适合于水产疫苗的开发。目前研究者们已在预防细菌、病毒感染和肿瘤增殖中对它开展了大量研究。乳酸菌载体的口服疫苗可发挥效用于粘膜，并在该部位作用，持久不断地合成和释放抗原蛋白，此过程能够刺激其产生特异性的分泌型IgA，且由该刺激产生的IgA抗体效价会高于由直接注射纯化好的抗原蛋白所产生的抗体效价[6]。与此同时，也有相关研究报道，乳酸菌载体疫苗通过对动物的鼻饲免疫从而诱发抗体特异性的细胞免疫，可以人为检测到Th1细胞因子(Th1 cytokines)、白细胞介素-2(IL-2)以及干扰素-γ(IFN-γ)的表达量的多少变化[7]。使用乳酸菌载体疫苗来抑制癌细胞的生长，主要是通过CD4+和 CD8+依赖的TC细胞的相关反应途径[8]。乳酸菌载体当中的外源蛋白相关高效表达的调节可通过组成型以及诱导型的启动子来实现，外源蛋白可采用乳酸菌的组成型蛋白表达系统进行持续而长久的表达，然而诱导型的蛋白表达系统则需要诱导物及抑制物活环境因子的诱导才能够实现蛋白的大量表达[9]。

本研究将乳酸菌分泌型蛋白Usp45的信号肽序列整合到含有组成型启动子的乳酸菌表达载体中，并在外源基因的末端携带6个组氨酸标签，构建抗嗜水气单胞菌口服疫苗载体，便于进一步研究检测在载体经过口服喂食后在甲鱼肠道中的表达情况，确定口服疫苗的有效性。

2。材料与方法

2。1 材料与试剂

2。1。1 细菌菌株及其生长条件

本实验中所用大肠杆菌DH5α在37 ℃ LB液体培养基中培养。嗜水气单胞菌TL1分离自浙江杭州的某甲鱼养殖场的一只患病的甲鱼肝脏。TL1的培养是在28℃条件下的LB培养基中进行的。乳酸菌MG1363的培养是在28℃条件下的MRS培养基中进行的。同时培养过程所用红霉素的工作浓度为200 μg/mL，氨苄青霉素的工作浓度为100 μg/mL。