3 成像实验 12

3。1 超分辨定位成像系统 12

3。2 成像实验 13

3。3 本章小结 15

结论 16

致谢 17

参考文献 18

1 绪论

一直以来,显微成像是人类探索微观世界,研究微生物和细胞功能的非常重要的工具。 1665年，英国物理学家胡克利用自己制作的显微镜观察植物组织，发现并命名了植物细胞 (cell)，1676年，荷兰科学家列文虎克用显微镜首次观察到了微生物，人类正式开启了探索 微观世界的大门。经过几个世纪以来科学家们的努力，显微成像技术得到了极大的发展和提 升，截至目前，显微成像的分辨率可以达到微米甚至纳米水平。其中，电子显微镜和扫描隧 道显微镜虽然能够实现极高的分辨效果[1]，但是这类成像技术无法实现特定结构的观测，样 品制备过程十分复杂，并且只能对固定细胞进行成像。而荧光显微成像技术由于其独特的特 异性标记成像以及能够对活细胞成像的能力倍受生物学家们的青睐，成为细胞生物学中最受 欢迎的成像方式[2]。

1。1 衍射极限

虽然光学显微成像在人类探索微观世界的过程中发挥了不可替代的作用，但是其自身也 有无法突破的成像缺陷，即衍射极限，衍射极限是由光的波动性本质引起的。在光学成像系 统中，由于光的衍射效应的存在，单个光源发出的光线经过系统后不能理想地汇聚于一点， 而是形成有一定大小的几何光斑，称之为艾里斑，即光学系统的点扩散函数，如图1。1所示。

目前，衡量光学成像系统分辨本领（即分辨率）的主要依据是瑞利判据。根据瑞利判据， 将一个点物衍射图样的中央极大位置与另一个点物衍射图样的第一个极小位置重合的状态 定义为光学系统的分辨极限，认为此时光学系统恰好可分辨开这两个点物[3]，如图1。2所示。 光学系统的分辨率表示为：

其中， 为光波波长， 为物方空间的介质折射率， 为物镜的数值孔径[4]。

瑞利判据示意图

根据瑞利判据，传统光学显微镜在可见光范围内的横向分辨率一般只能达到200nm，轴 向分辨率约为500nm，在进行大尺度生物样品（如生物组织）观察时，这样的分辨率是能够 满足要求的，但是如果需要观察更加精细的生物结构（如细胞内蛋白质、细胞器及细胞骨架 等）或者研究细胞内大分子之间的相互作用，传统光学显微镜就无法获取清晰的生物图像。 因此，需要发展一种分辨率更高的光学显微成像技术，来满足现代生物学领域的研究需求。 1。2 超分辨显微成像技术

科学家们在提升光学显微成像分辨率的问题上做了很多的工作，也提出了很多提升分辨 率的方法，比如双光子、共聚焦和4pi等成像方法[5]，但是这些技术在原理上依旧受限于衍射 极限。双光子成像方法的主要特点是降低了光毒性和增加成像深度[6]；共聚焦则是提高了系 统在光轴方向的层析能力、抑制非焦平面的噪声，增大信噪比[7]；4pi技术主要是增大了系统 的轴向分辨率[8]。这三种成像技术虽然都对提高光学系统分辨率起到了一定的推动作用，但 是它们能够达到的极限分辨率不超过100nm，也没有真正意义上突破衍射极限。