物结构的超高分辨率图像。最终实现的超分辨成像的分辨率不再受限于衍射极限，而是取决 于单分子的定位精度和定位密度，也就是说图像的分辨率仅取决于采样单个荧光分子收集的 荧光光子数和最终采样的分子数目[18]，从而从本质上突破了由光波长和物镜数值孔径决定的 衍射极限。因此，只要设法增大荧光分子发射的光子数和实现高密度荧光标记，就可以获得 超高分辨率的图像。

图1。3 超分辨定位成像原理示意图

1。3  成像缓冲液的更换

超分辨定位成像技术是利用荧光标记物的光致转换特性实现的，因此成像分辨率很大程 度上取决于所选荧光探针的某些物化性质，比如：单分子发射光子数、光学稳定性、对比度 以及占空比等等[19]。但是，对于dSTORM成像来说，除了荧光探针自身的物理和化学性质会 对成像效果产生重要影响之外，成像缓冲液也是非常重要的影响因素，因为缓冲液的质量决 定了控制荧光分子on/off状态转换的效果。dSTORM成像时，荧光染料需要借助缓冲液(buffer solution)进行成像。缓冲液中通常含有一定浓度的硫醇化合物(比如βME或MEA)来实现荧光 染料的光转换，葡萄糖氧化酶溶液作为除氧剂，为实现稀疏激活的荧光分子定位成像提供必 要的条件[18, 20, 21]。除此之外，缓冲液所含物质种类及浓度的不同还会影响荧光分子的漂白速

率常数( )。选择合适的缓冲液能够加速分子的漂白，并且有助于确保未被激活的荧光分 子处于稳定的黑暗状态，从而提高显微成像的时空分辨率。因此，对于不同的荧光染料，使 用不同的缓冲液最终获得的成像效果有很大差异，即每一种荧光染料对应的最佳缓冲液也不 一样[21, 22]。

成像缓冲液是影响成像效果的非常关键的因素。但是，由于葡萄糖氧化酶等物质的存在， 成像缓冲液具有一定的时效。一方面，常温下放置时间太长会由于氧化酶的分解无法很好地 发挥除氧剂的作用从而影响成像效果；另一方面，由于超分辨定位成像需要多次重复单分子 定位的过程，以采样足够数量的分子，获得超高分辨率的图像，因此，对生物大组织一次完 整的成像过程可能需要几个小时的时间。所以，在进行长时间成像实验时，需要考虑如何在 不影响成像的前提下，及时更换失效的缓冲液。除此之外，用dSTORM进行多色成像实验时，

一个常用的方法是用对应不同激活和激发光波长的多种染料共同标记生物样品。这种方法首 先用一定波长的激活和激发光照射样品，采样某一种染料的荧光分子进行定位成像，待完成 该染料的采样之后，更换激活和激发光采样另外一种染料的荧光分子。重复这些操作直到完 成所有染料的采样。最后，对单一荧光染料图像中的荧光分子进行定位及图像配准，得到生 物样品的多色超分辨图像[23]。因为不同染料的最佳缓冲液不同，所以在成像不同染料时需要 及时更换缓冲液，以确保每一种荧光染料都能发挥最佳的成像效果。

目前，成像样品的制备方式主要有两种。一种是封片的方式：用指甲油或封片胶将成像 样品密封在两玻片之间，密封之后的样品便于多次观察和长期存放，但是，由于缓冲液的时 效问题，这种方法只适合用于制作不需要更换缓冲液的成像样品，比如说荧光小球。另一种 是开放的制备方式：在培养皿中培养细胞并用荧光标记物进行标记，进行成像实验时再向培 养皿中加入临时配好的缓冲液；需要更换缓冲液时，将其从培养皿中吸出，加入新的缓冲液。 这种方式便于及时更换失效的缓冲液，但是开放式的结构使得在更换缓冲液时会不可避免地 导致培养皿产生微小的移动，从而影响dSTORM多色成像过程中不同颜色通道的图像配准文献综述