材料与方法

1。材料

1。1 主要仪器与设备

Milli-Q 超纯水仪（使用的是美国Millipore）

电热恒温干燥箱（使用的是上海精宏实验设备有限公司）

低温高速离心机（使用的是德国Effendorf公司）

高精密度电子天平（使用的是梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）

酶标仪（使用的是美国 BIO RAD）

电泳装置仪器（使用的是美国 BIO RAD）

聚偏二氟乙烯膜（使用的是PVDF膜）（使用的是美国Millipore）

凝胶成像仪（使用的是上海天能科技有限公司）论文网

1。2 主要化学试剂

1。0mol/L Tris·HCL（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

Tween20（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

单去污剂裂解液（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

BCA试剂盒（购买于江苏凯基生物技术股份有限公司）

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

TEMED（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

兔抗MAP4K4多克隆抗体（购买于abcam）

兔抗GAPDH单克隆抗体（购买于abcam）

兔抗Claudin-5多克隆抗体（购买于abcam）

兔抗VE多克隆抗体（购买于abcam）

羊抗兔荧光抗体（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

ECL化学发光试剂盒（购买于中国武汉博士德生物科技有限公司）

1。3主要试剂的配制

1。74mg/ml PMSF（将PMSF0。174g溶于异丙醇100ml中，分装，于-20℃条件下保存）

10％SDS（SDS10g，加蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，于室温条件下保存，如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用）

10％过硫酸铵（0。1g过硫酸铵溶于1。0ml超纯水中，于-20℃条件下保存，保存时间为一周）

0。01mol/L PBS（19ml0。2mol/lNaH2PO4 、81ml0。2mol/LNa2HPO4、17gNaCl、加蒸馏水至2000ml）

电泳缓冲液（3。03gTris（MW121。14）、18。77g甘氨酸（MW75。07）、1gSDS、加蒸馏水至1000ml，溶解后于室温条件下保存，每次溶液可重复使用3~5次）

转移缓冲液（5。8gTris（MW121。14）、2。9g甘氨酸（MW75。07）、0。37gSDS、200ml甲醇、加蒸馏水至1000ml，溶解后于室温条件下保存，每次溶液可重复使用3~5次）

TBS缓冲液（10ml1mol/L Tris·HCl（PH7。5）、8。8gNaCl、加蒸馏水至1000ml）

TBST缓冲液（1。65ml20％Tween、700mlTBS，最好现用现配）文献综述

封闭液（5g 5％脱脂奶粉溶于100ml TBST中，现用现配，一次性使用）

2。实验方法

2。1实验动物与分组

随机选取健康成年雄性C57小鼠50只，体重约20g，均由上海斯莱克公司提供，符合国家二级实验动物标准。实验随机分为sham组（只做手术不撞击）、损伤组（进行撞击）和对照组（损伤组中损伤侧的对侧，不手术不撞击），sham组和损伤组每组25只，对照组为损伤组中损伤侧的对侧，按照时间点各组再分为5个亚组，每组5只：1h、3h、6h、12h、24h。

2。2 TBI模型的建立

    根据Feeney’s自由落体法的原理建立小鼠控制性脑皮质撞击伤模型，用4％水合氯醛腹腔麻醉小鼠，4mg/kg。头顶部剪毛、消毒。沿头皮正中切开头皮，在左侧顶骨用骨钻钻开，暴露硬脑膜。用电子颅脑损伤仪（eCCI）自由落下造成小鼠左侧脑实质损伤，缝合伤口。小鼠在TBI后各时间点心脏灌流，取脑。 当由于其他原因使得实验组动物数目不足原定数时，随机抽样原则补齐并用同法重新造模。