星形胶质细胞对神经神经突触的形成和功能至关重要，是中枢神经系统发挥功能不可缺少的组成部分。dnEGFR信号通路[3]在星形胶质细胞的发育中起重要作用，dnEGFR过度活化会导致星形胶质细胞增生。已有大量报道证实由于神经元死亡引起星形胶质细胞增生，从而导致神经疾病，并探讨靶向异常增殖的星形胶质细胞作为这类神经疾病的靶点，但是其分子机制尚不清楚。临床研究发现，在多种肿瘤包括乳腺癌和星形胶质瘤中dnEGFR过表达比例较高，肿瘤患者患神经疾病的比例较正常人群高，暗示dnEGFR高表达可能导致神经元发育和突触功能异常。

在中枢神经系统胶质瘤细胞周围，反应性星形胶质细胞的存在表明这两种类型的细胞有相互作用的可能性。怀疑胶质瘤细胞是否使用星形胶质细胞环境调节基质金属蛋白酶-2（MMP-2）[4]----一种与胶质瘤细胞侵袭有关的蛋白水解酶。经现有研究表明神经胶质细胞利用他们的特异细胞环境激活MMP-2，引起神经胶质瘤细胞侵袭性的增加。反应性星形胶质细胞是胶质瘤微环境的重要组成部分。在主要的星形胶质细胞间隙连接蛋白中，缝隙连接蛋白43（Cx43）[5]是主要的间隙连接蛋白，尤其在肿瘤周围区域，胶质瘤相关星形胶质细胞的表达明显增强。经现有研究表明，下调Cx43介导的细胞间通讯与肿瘤细胞恶性程度增加有关，改变星形胶质细胞Cx43的功能，如更换野生型等位基因与C-末端截断Cx43突变体而表现出细胞间的耦合减少，足以减少神经胶质瘤扩散到脑实质。表明星形胶质细胞Cx43在侵袭性小生境形成中的作用以及通过操纵微环境提高控制胶质瘤发展的可能性[6-7]。

在本课题中，发现实验组转基因杂交小鼠Mlc1-dnEGFR在适宜生长环境时的正常生长发育不受星形胶质细胞的影响，但当其处在特殊病理情况--特指脑瘤状态时，生长环境一致，荷瘤小鼠的存活状况以及生理功能均发生改变，表明受到星形胶质细胞及其分泌的因子的影响。

本课题通过一系列体内和体外实验，涉及转基因小鼠获得、细胞系培养、基因型鉴定、qPCR、脑立体定位注射、原代细胞培养和体外细胞增殖实验，研究星形胶质细胞对脑瘤发展的影响。重点通过脑立体定位注射实验和体外细胞增殖实验，研究星形胶质细胞调控脑瘤发展的细胞学机制。

1。材料与方法

 1。1实验材料

1。1。1转基因鼠来源

   从美国Jackson Lab引进具有组成型激活dnEFGR突变体的TetRE-dnEFGR鼠系。TetRE是由tetracycline控制的转录元件，当与tTA蛋白结合时可启动下游基因-dnEFGR的转录，而外加tetracycline的衍生物doxcycline（Dox）可以与tTA结合，阻碍tTA与TetRE的结合，从而阻断下游基因的表达----这种条件性控制表达系统称为Tet-off系统[8]。另外，从日本Riken Institute引进星形胶质细胞特异启动子Mlc1启动表达tTA蛋白的转基因鼠系Mlc1-tTA。将两种小鼠杂交，得到Mlc1-tTA；TetRE-dnEFGR子代，用于接下来的实验研究。当没有喂饲Dox时，dnEFGR在星形胶质细胞中特异表达，下游信号被持续激活；而喂饲了Dox后，dnEFGR的表达被阻断，星形胶质细胞中dnEFGR信号通路处于正常状态（图1）。From~优E尔L论E文W网wWw.YoUeRw.com 加QQ7520.18766

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图1 Mlc1-tTA/TetRE-dnEGFR (Tet-Off)系统 

1。1。2主要试剂和仪器

  主要材料与试剂   

材料与试剂 公司

C6细胞、U87MG细胞

DMEM

中科院上海细胞库

吉诺生物医药技术有限公司

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