6)DMEM高糖培养基                  塞默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司

7)甘油三酯测定试剂盒               浙江东瓯诊断产品有限公司

8)葡萄糖测定试剂盒                 上海荣盛生物药业有限公司

9)工业级乙醇                       杭州汇普公司

10)MTT                              Amresco 

11)胰蛋白酶(Trpsin)                 Solarbio

12)青/链霉素双抗                   Solarbio

13)二甲基亚砜(DMSO)                  Sigma

14)3一异丁基一1一甲基黄嘌呤(IBMX)  Sigma

15)地塞米松(DEX)                     Sigma

16)lnsulin                           Sigma

17)PBS(磷酸盐缓冲液)                 Cwbio

18)10cm培养皿                        Fisher

1。3  主要试剂的制备

1)NBS培养液:50 mLNBS与5 ml青/链霉素双抗加入450 mL DMEM 培养基,配成血清浓度为10%的溶液,4℃储存。

2)FBS培养液:5O mLFBS与5ml青/链霉素双抗加入450 mL DMEM培养基,配成血清浓度为10%的溶液,4℃储存。

3)诱导剂的配制:①IBMX:称取10 mg IBMX,溶于 0。9 ml DMSO, 配置成终浓度为 0。5 M的母液,-20℃保存。②DEX:称取DEX 2mg, 溶于2 ml 无水乙醇中,再加入 8 ml PBS,过滤,配置为浓度即为1mM的母液,-20℃保存。③Insulin:取10 mg胰岛素至于2 ml EP管中,加超纯水500 μl,涡旋振荡,再加0。2 M HCl(50-100μl),最后加超纯水至1 ml,0。22 μl微孔滤膜过滤除菌,终浓度为10 mg/ml,-20度保存。

3)MTT溶液:每次实验称取MTT用PBS溶解,使MTT浓度为2μg/μL,用锡箔纸在4℃ 下避光保存,一周内使用。

4)油红O染液:通常每次实验取6-8 mL油红溶液,临用以油红O:超纯水为3:2稀释,过滤后2h内使用。论文网

5)葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法试剂配制:将R1试剂和R2试剂等量混合均匀,现配现用。实验方法

2。实验方法

2。1   腺梗豨莶草水提物(XXC-W)的提取

2。2   3T3-L1细胞的培养与诱导分化与XXC-W的活性鉴定

(1)3T3-L1细胞的培养与传代:培养皿中加入用含10%NBS与1%双抗的DMEM高糖培养基(CM)10 mL,置于37。C、5%CO2培养箱内培养;当细胞贴壁生长到培养皿约85%~95%时,传代。加入胰蛋白酶消化液约400μl,在倒置显微镜下观察细胞形态细胞近乎缩成圆形、细胞之间间隙增大、颜色变亮,此时加入10 mL CM培养基, 800 r/min离心5 min,弃去上清,加入1 ml CM,血球计数板上进行计数;然后接种200000细胞到新的培养皿中放入培养箱中继续培养。

(2)诱导分化:本实验采用“鸡尾酒法”即用IBMX、DEX和Insulin诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的3T3-L1脂肪细胞。方法如下:

1)接种:将3T3-L1每孔约5×104个细胞接种于24孔培养板,每孔加入1ml CM培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养;

2)加诱导剂I(InducerⅠ):待细胞密度长至80-90%,即约融合2天后,每孔加入终浓度为0。5 mmol/L IBMX、1 umol/LDEX和Insulin 10ug/ml的含10%FBS1%双抗的高糖DMEM培养;

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