2）按反应体系比例配制基因组DNA混合液：分别取5×gDNA Buffer 2 ul、Total RNA 400ng，用RNase-Free ddH2O补足样品至10 ul，上述试剂操作完成后将管中液体混匀，此步骤应在离心机短暂离心，使管壁的液体混合均匀，将其置于42℃，孵育3分钟，后将其置于冰上保存。

2）按反转录反应体系比例配制混合液：分别取10×Fast RT Buffer 2ul、RT Enzyme Mix 1 ul、FQ-RT Primer Mix 2 ul，加RNase-Free ddH2O 补足至10 ul。此步骤可将相同的剂量的试剂先混合，再分别加入各待测样本中。

4）将配制好的反转录反应中的混合液依次加到gDNA去除步骤的反应液中，完成后应在离心机上进行短暂的离心，使液体充分混匀。

5）将完成的反应液放置在仪器中设置42℃,15分钟；再设置95℃，3分钟，之后将温度设为4℃，所得的cDNA用于后续实验，放置在-70℃冰箱中冷冻保存。

2。3。3荧光定量PCR

参照SuperReal 荧光定量预混试剂盒 增强版（SYBR Green），按照试剂盒的提供的方法进行操作。

1）实验试剂准备：将cDNA解冻，将保存在-20℃冰箱的引物；2×SuperReal PreMix Plus和RNase-Free ddH2O取出，并将所有试剂在室温下解冻，按比例配置混匀。

2）稀释：将cDNA中加入20ul RNase-Free ddH2O至终浓度为10ug/ml。

3）配制Real Time PCR反应液：2×SuperReal PreMix Plus 5ul、cDNA 2ul、引物0。5ul、RNase-Free ddH2O 2。5ul将样品混合。

4）盖上反应管，混匀。此步骤应短暂离心，确保溶液混匀。

5）将样品放置于荧光定量PCR仪器中。设置电脑PikoReal Software程序：选择荧光基团为SYBR Green,设置解链温度95℃、时间15分钟。循环数40×、变性温度95℃、变性时间10秒、退火温度为61℃,退火时间为31秒,点击开始，电脑自动采集数据。文献综述

2。3。4整理PCR实验数据：

待反应程序结束，确定实验PCR每种目的基因的熔解曲线以确定实验的准确性，记录各样品Ct (threshold cycle)值。（Ct值：指每个反应管内的荧光信号强度到达设定的阈值时候所经历的循环数，循环数越多，表明管内的浓度越低。）

样品的Ct值与对应的DNA模版的原始拷贝数量的对数有一定的线性关系。由此得出，目的基因的Ct值-内参基因所得的dCt和cDNA模板的原来的拷贝数量的对数存在线性关系，本实验统计用2-△△Ct线性结果算出各实验样品mRNA的表达水平。