1。引言

基因治疗是在靶细胞内导入正常的外源基因，用以纠正或者补偿由于基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的[1]。也就是在病人适当的受体细胞中插入通过基因转移技术植入的外源基因，使某种疾病能被外源基因制造的产物治疗。从更广泛的定义来说，从DNA水平采取的治疗某些疾病的方法和新技术也包含在基因治疗中。

要将治疗基因成功导入受体细胞中，安全高效的转基因载体是基因治疗成功的关键。CRISPR/Cas9是一种新兴的基因组编辑系统，它以一种简便、高效、多样化的方式为基因组编辑提供了一种全新的操作技术,CRISPR/Cas9系统与另两项基因组编辑技术ZFN和TALEN相比，具有操作更简便和效率更高的优势。且更容易得到纯合子突变体，并可在不同的位点同时引入多个突变[3]。这使CRISPR/Cas9在基因功能研究、动植物育种和基因治疗等各方面都有着广阔的应用前景。细菌和古细菌在漫长的演变进化过程中形成了CRISPR/Cas9。它是一种适应性免疫防御。可以用来防范病毒的侵入以及侵入的外源DNA。此系统的工作原理是 crRNA通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，这个复合物能够引导核酸酶Cas9蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（short guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA的定点切割[2] 。发生切割的位点会诱发细胞进行DNA重组修复，在Cas9对基因组DNA进行定点切割的同时引入切割位点的同源序列，则可通过同源重组将外源DNA定点整合到该切割位点中，实现基因的定点插入。因此这项技术是理想的基因治疗工具。来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766

然而，在利用CRISPR/Cas9进行基因治疗时，要确保基因治疗的效果需要CRISPR/Cas9介导的基因定点插入具有较高的效率，以达到使导入的基因高效表达的目的。但目前CRISPR/Cas9介导的基因整合效率仍然受到许多因素的影响而难以满足基因治疗的需求。在此，我们将探索提高CRSIPR/Cas9系统基因整合效率的新方法，具体是通过改造CRSIPR/Cas9系统的供体质粒（Donor）序列，使Donor质粒在与CRSIPR/Cas9一起转入细胞时可以形成更有利于同源重组的形态，从而提高Donor质粒在同源重组中的效率，使Donor质粒所携带的目的基因可以更高效地整合到靶向位点中。

我们知道在同源重组中，线性化的DNA要比环形DNA具有更高的重组效率，但在细胞转染中，环形DNA比线性DNA的转染效率更高，这两者在同一个转染反应中很难同时满足。为充分利用环形DNA和线性DNA的优点，提高CRSIPR/Cas9系统在基因整合中的效率。我们提出在Donor质粒中引入CRISPR/Cas9靶位点，这样在转染时Donor质粒以环形DNA形式转染，当环形Donor质粒被转入细胞后，在CRISPR/Cas9的识别和酶切下，Donor质粒可被酶切而线性化，这时Donor质粒可作为线性化的同源重组DNA参与同源重组过程，通过这种方法可以同时综合利用环形DNA的高转染效率和线性DNA的高重组率，从而增强基因整合的效率。

2。实验材料和方法论文网

2。1 实验试剂与设备

①实验试剂：

表1。实验试剂

                   实验试剂                                   品牌厂家

            DMEM basic（1X）培养液                            Gibco

              HyClone PBS缓冲液                       上海联硕生物科技有限公司