细胞冻存罐                                          Thermo Scientific

移液管2ml、Stripette 移液管5ml、移液管10ml               Thermo Scientific  Costar

2。2 实验方法文献综述

我们在GFP-Donor中通过定点突变引入CRISPR/Cas9酶切位点，合成CRSIPR/Cas9识别序列，以体外酶切实验验证产物。为确定GFP－Donor/m质粒是否影响CRISPR/Cas9对基因组Rosa26靶位点的酶切效率。我们将以CRISPR/Cas9和GFP－Donor/m质粒共转染3T3细胞，提取转染后的细胞DNA，以T7E1酶切实验检测CRISPR/Cas9对于Rosa26靶位点的酶切效率，并检测GFP－Donor/m质粒是否在细胞内可被CRISPR/Cas9成功酶切，同时对比GFP－Donor/m质粒的转入是否影响了CRISPR/Cas9对于基因组Rosa26靶位点的酶切效率。我们将针对Rosa26靶位点设计引物进行基因组DNA的Junction PCR，检测GFP基因是否成功地定点整合进入Rosa26靶位点。以确定GFP－Donor/m质粒是否可增加GFP基因的整合效率。我们通过长时间传代培养转染后的3T3细胞，通过流式细胞分析技术分析细胞中GFP表达的稳定性和表达水平，确定GFP－Donor/m质粒转染是否可增加GFP在细胞中的稳定表达水平。