2。2。1。4重组大肠杆菌中透明颤菌血红蛋白的发酵 12

2。2。2重组大肠杆菌发酵培养 13

2。2。2。1 重组大肠杆菌AT菌培养活化及抗性筛选 13

2。2。2。2 单克隆培养 13

2。2。2。3一级种子培养： 13

2。2。2。4二级种子培养 13

2。2。2。5乙酰氨基葡萄糖及葡萄糖标准曲线制作及测定 13

2。2。2。6摇瓶发酵培养 14

3。结果与讨论 14

3。1 AT菌的活化培养 14

3。2二级种子培养 14

3。3摇瓶发酵培养 14

3。4 VHb蛋白诱导的检测 18

参考文献 19

致谢 20

1 引言

1。1 氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖及透明颤菌血红蛋白的简介

氨基葡萄糖（Glucosamine），也被称做2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose)，它的英文缩写为GlcN，它是葡萄糖2号位C的羟基被氨基取代后的化合物，氨基葡萄糖是第一个被确认结构的氨基单糖 [1,2]。目前，对于氨基葡萄糖相关的产品应用大多是一些盐酸盐：氨基葡萄糖硫酸盐(图 1-1)、氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐以及乙酰氨基葡萄糖。GlcN在很多有机体中都发现过，含量比较多的包括细菌、丝状真菌、酵母菌，甚至在植物体内和动物体内都有发现。GlcN的生产方法有很多种，但是主要的就有三种：甲壳素水解法、微生物发酵法以及生物转化法。GlcN 检测方法主要有薄层层析法、滴定法、比色法及高效液相色谱法（HPLC）。比色法作为经典的检测方法，在GlcN 含量检测上有较广泛的应用，应用最多的是Elson-Morgan法，它是根据氨基葡萄糖中的官能团反应后在530nm处的吸光值来判断氨基葡萄糖的量，主要用于发酵液中GlcN 含量的测定。

图1-1 氨基葡萄糖相关化合物的结构式

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc，CAS134451-94-8)是氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)的葡萄糖的一个氢原子被乙酰氨基取代后的一种衍生物，来自优W尔Y论W文C网WWw.YoueRw.com 加QQ7520,18766 具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能[3]。某些疾病的发生可能与机体不能正常合成和利用氨基葡萄糖有关，细胞膜、细胞间液和细胞识别等过程也受乙酰葡萄糖胺的影响。乙酰氨基葡萄糖在自然界中很多物质中存在，特别是海洋生物类动物的甲壳中含量最高。GlcNAc的分子式为C8H15NO6，分子量为221。21，白色至微黄色粉末，易溶于水，难溶于乙醇、丙醇等有机溶剂，熔点198-205℃，2-8℃密封避光保存[4]。结构如图1-2所示：

图1-2 GlcNAc结构图

透明颤菌（Vitreoscilla stercoraria）是一种好氧丝状革兰氏阴性菌，最早发现于1870年，是Beggiatoa家族中的一员，它是从淤泥、牛粪等厌氧环境中分离出来的。但是，直到1949年，Pringsheim等[5]才更进一步对进行纯培养，将其定义为一个新的菌科：Vitreoscillaeeace。1974年，Webster等从Vitreoscilla菌中提取纯化得到此蛋白，并在1978年将其命名为“细胞色素O（cytochrome O, CyO）”蛋白[6]。Tyree等人纯化了VHb蛋白，发现VHb蛋白是由两个完全相同的相对分子量为15775的亚基和两个b型血红素组成，为同源二聚体，每个亚基有两个b型血红素，亚基的分子量大约为15。7kDa[8]，此后Wakabayashi公布了VHb蛋白的146个氨基酸序列[9]。每个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋区（A、B、E、F、G和H），其三维结构［8］见图1-3，而真核生物的血红蛋白有8个α-螺旋区（A、B、C、D、E、F、G和H）。VHb是迄今发现的唯一一种原核生物血红蛋白。