3-nitrotyrosine）。3-NT 的形成在很大程度上会直接或间接影响蛋白质的功能与结构。一般

来说，对于一个机体，当它在遭受到一些有害刺激时，它体内自由基会大量增加，通常包 括一氧化氮(NO) 、羟自由基( ·OH )、过氧化亚硝酸阴离子( ONOO-)、过氧化氢（ H2O2 ） 等，使体内氧化能力（ Oxidant ）超过抗氧化能力( Anti-Oxidant )，引起细胞内蛋白质硝 基化( Protein nitrocellulose )及 DNA 损害、酶变性、生物膜脂质过氧化，最后导致细胞死 亡与凋亡，甚至发生疾病。活性氮簇(  RNS  ) 和活性氧簇(  ROS  ) 是引起硝化应激 

（ Nitrification Stress ,NS ）和氧化应激（ Oxidative Stress ,OS ）的主要原因。氧化应激 伴随着硝化应激，活性氮簇的形成离不开活性氧簇，同时，RNS/ROS 水平的升高也会导 致蛋白质 Tyr 的硝基化，从而生成与酪氨酸结构不一样的 3 - 硝基酪氨酸。在这些分子中。 ONOO-既是一种强硝化剂( Nitrating agent )，又是一种强氧化剂，它的性质非常活泼，而 且能够迅速的与周围物的质发生一些反应。它一般就是引起蛋白质发生 Tyr 硝基化损伤的 主要因素。人体内的 ONOO-的半衰期通常是一定的，而且时间很短，因此硝基酪氨酸

（ Nitrotyrosine ）在一定程度上可以作为一种表示体内蛋白质被 ONOO-等攻击，然后发 生一些变化而留下的一种“分子指纹( molecularfingerprint )”[11]。

蛋白质中的酪氨酸磷酸化（ tyrosine phosphorylation ）不同于酪氨酸硝基化，硝化反 应发生在羟基上的 3 位，与硝基化不同，磷酸化都是发生在物质的 4 位。Tyr 硝基化时， 羟基的 pKa 值会降低 2—3 个单位。在生理反应条件下，负电荷会在含有 Nitrotyrosine 的 蛋白质上发生聚积反应，从而增加蛋白质的空间位阻，从而会改变蛋白质周围的化学环境， 使蛋白质的结构（ protein structure ）发生一定变化，如酶（ enzyme ferment ）催化活 性改变，新的抗原（ antigen ）表位生成、影响 tyrosine phosphorylation 及代谢方式调整 等[12]。游离的硝基酪氨酸可以通过诱导过氧化氢的产生从而介导 DNA 的损伤，损害细胞 的各种功能，尤其 会影响 protein 的转录与合成。在细胞 信号转导中， tyrosine phosphorylation 具有蘑要的作用细胞信号转导（ signal transduction ），而酪氨酸硝基化 后抑制了其磷酸化（ phosphorylation ），导致信号转导过程失控。动物模型研究表示，在 NS 或 OS 过程中，线粒体( Chondriosome , CD )内有些重要的蛋白质酶类，如细胞色素 c、 超氧化物歧化酶、三磷酸腺苷酶和琥珀酰辅酶 A 合成酶以及电压依赖的阴离子通道等发 生 tyrosine phosphorylation，从而引起呼吸链的传递性障碍，使 CD 合成 ATP 的数量减少， 甚至导致细胞内能量发生耗竭，出现细胞凋亡以及细胞的坏死[13]。

目前蛋白质硝基化损伤的研究方法主要有：生物素置换法、Western blots 法、生物素 置换法结合液相色谱-串联质谱法分离、纯化及鉴定被亚硝基化损伤的靶蛋白、SNO 位点 鉴定法直接鉴定亚硝基化损伤蛋白半胱氨酸靶位点、同位素代码亲和标签技术结合生物素 置换法同时鉴定和定量亚硝基化损伤位点等，这些方法的优点是省去了繁冗的凝胶电泳步 骤，使分析蛋白亚硝基化损伤的方法在技术上又得到了进一步的改善和提升。可见目前蛋 白质硝基化损伤的检测手段主要集中在质谱鉴定方法，该方法的缺点是要使用同位素，但 该方法需要的仪器设备昂贵，前样本处理过程复杂且样品损失严重，还面临如何将修饰后 蛋白样品从复杂体系中纯化出来等问题。因此开发快速灵敏的无损检测手段成为蛋白质损