此方法使用单个样品瓶或一个96孔超滤装置来分离游药物与其血浆蛋白的结合部分。将血浆样品的等分试样装载到具有特定MW截留（MWCO）的膜的超滤装置的上室中。将装置放入离心机，将溶液通过膜超滤。 未结合的药物与液体一起通过膜进入接受器室，而结合的药物则保留在装载室中。在以下假设下进行超滤：（i）药物不与膜结合;（ii）血浆蛋白没有渗漏物通过膜; （iii）平衡常数不随着蛋白质在分离过程中逐渐浓缩而改变;和（iv）膜对药物和水的渗透率是相同的。在应用单个小瓶时，许多研究人员预设MWCO为10,000Da，血浆，血清或操作缓冲液中的药物浓度为～10mM，装载体积为400mL，在2000g 离心30分钟后，可收集60ml滤液（通常小于滤液的五分之一）[9,17]。测试药物在受体中的浓度是定量的，并计算未结合的部分等于该超滤液浓度除以总初始浓度。尽管超滤是一种特别适用于那些不稳定药物的简单快速的技术，但该技术的主要缺点是药物与由乙酸纤维素和塑料装置组成的滤膜的非特异性结合。据认为，非特异性结合有时可影响20-30%的测试药物。     论文网

非特异性结合问题通常可以通过用5%苯扎氯铵（对于碱性药物）或5%的吐温.80对于疏水和酸性药物）预处理滤膜来克服[18]。吐温.80是一种非离子的表面活性剂，而苯扎氯铵是阳离子表面活性剂。减少药物与过滤膜的非特异性结合的另一种方法并且装置通过简单地将它们浸入37℃下的预饱和活化二甲硅油（经典的硅化剂）悬浮液（室温可能工作）来“硅化”它们，然后在使用前用去离子水冲洗它们。也可以使用硅烷化玻璃器皿代替塑料或合成装置。在所有情况下，进行非特异性结合对照实验是非常重要的。

方程式（1）-（3）可以用来确定NSB和蛋白结合率：

                                                 （1）

                                    （2）

                                           （3）

其中NSB表示非特异性结合；CBD缓冲液的药物浓度（PBS；或者等离子水）；CBF缓冲液（或等离子水）的药物经过超滤后滤液中的药物浓度；CSD血清中的药物浓度（或血浆）；CSF血清（或血浆）中的药物经超滤后滤液中的药物浓度；以及Fu是药物的游离分数。   

血浆超滤液可以如下制备[19]：将血浆加入到预备离心超滤器（浓缩离心管-10）中，然后使用浓缩离心管-10再次对滤液进行超滤，以获得无蛋白质的血浆超滤液。可以将测试药物定量加入到血浆超滤液中，然后将其等分为两等分试样，一个用于CBD测定，另一个用于CBF。假定与血浆蛋白的结合是平衡（共价和/或配位结合），并且药物在血液中而不是单独的血浆，结合时药物同时分配至红细胞并平衡血浆蛋白。在这种情况下，Schuhmacher[20]修改和改进了方法[21]来研究药物蛋白结合。 

（2） 平衡透析法

平衡透析法[21]是传统和成熟的膜分离技术，通常被认为是“黄金标准”，主要用于蛋白质和小分子结合的定量研究。平衡透析法的工作原理是基于不同的分子大小或重量，大分子溶液和小分子溶液放置只允许小分子通过而聚合物不允许透过半透膜两侧，小分子药物在没有外部条件刺激下可以由扩散通过半透膜。当透析达到平衡时，测量膜两侧溶液中小分子的浓度，并通过计算分析大分子和小分子的数据。基本上确定药物跨越缓冲液和血清或纯化的血清成分之间的半透膜的分配。因为物质穿过对称膜的被动转运与该物质的浓度成比例，当游离药物的浓度在膜的每一侧相同时将达到平衡。