测定化合物毒性根据毒性类型的不同，其测定的方式方法也不相同。急性毒性是人或实验动物一次或24小时内重复数次接触到外源化学物，并且发生短期的毒性的效应。对于急性毒性检测的最重要指标是LD50。并且运用LD50测试求和出受试化学物的致死剂量，对外源性化学物质的急性毒性进行了分类，并对亚慢性毒性试验和其他毒理学实验提供了接触剂量和观察指标。亚慢性毒性是指机体连续较长时期接触外源化学物所发生的中毒效应。这种毒性试验是根据研究受试物的亚慢性毒性的剂量一反应（效应）关系，从而确定其观察到产生有害作用的最低试剂量（LOAEL）和没有观察到有害作用的最高剂量（NOAEL），并对此初步提出此受试物的安全限量参考数值。慢性毒性是反复接触外源性化学物质在实验动物或人的长期毒性作用。亚慢性和慢性毒性试验分别选用啮齿类、非啮齿类动物，其目的是为降低外源化合物对不同种类的动物的毒性效应是不同的，结果再外推到人的偏差。

急性毒性试验扮演着重要的角色，尤其是在新药开发和测试中。急性毒性试验是指在一次或24小时内进行重复多次的染毒的试验，是初步的毒性研究。在研究化合物毒性的过程中，由于化学结构和活性成分、药理、毒理学的特点是不同的，毒性是不同的，有的则难以观察是否存在毒性反应。根据试验药物的各项特性，急性毒性试验包括以下几类：1、为半数致死量的测定急性毒性（LD50）的测试方法。2、最大耐受剂量（MTD）试验方法。最大耐受剂量是导致动物出现毒性的剂量，但不会产生动物的死亡。3．最大受试药物剂量的试验方法：在合理的浓度和合理的量的情况下，最大剂量的药物被用来给实验动物的最大剂量，并观察动物的反应。4．单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择并使用5.0mg/kg、50.0mg/kg、500.0mg/kg和2000.0mg/kg四个固定的剂量。我们以前的工作已筛选出一种具有抑制耐药菌活性的含氟咔唑类化合物，本研究拟通过测定LD50评价其急性毒性[10]。

2 材料

2.1试剂 

二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO），一种具有抑菌活性的含氟咔唑类化合物，溶菌肉汤培养基（lysogeny broth，LB）固体培养基及液体培养基，普通小鼠饲料（购自徐州医科大学）

2.2仪器

1mL注射器、灌胃针头（每组两套）、记号笔、小鼠笼、电子天平、1L大烧杯，1mL小试管，移液枪头，酶标仪

2.3实验小鼠 

健康成年小鼠雌雄各半，体重18g-25g左右（购于徐州医科大学动物实验中心）。

2.4 菌种

测试抑菌活性的菌种为野生型大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphilococcus aureus）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant S. aureus, MRSA），上述菌种保藏于江苏师范大学江苏省药用植物重点实验室。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

3方法

3.1抑菌实验

实验所用的菌种冷冻保存于超低温冰箱中，实验时，接种至LB培养基上，并放入37℃恒温培养箱中过夜培养。用挑菌针挑取平板上的单菌落至含有LB液体培养基的试管中。将上述试管置于37℃下振荡培养。每隔一段时间取出少量菌液用酶标仪测定其在波长600mm处的光密度（optical density, OD600）值，当菌液OD600值为1 时取出菌液，用LB培养液稀释5000倍，备用。

化合物溶解在DMSO中，依次二倍稀释，成梯度溶液，最高浓度为10 mg/ml，最低浓度至3.125mg/ml。在无菌96-孔板的各孔中分别加入1μl各浓度的化合物溶液及100μl稀释后的菌液，混匀。另取6个孔作为对照，其中3个孔加入1μl DMSO和100μl菌液，另外3个孔加入1μl的氨苄青霉素（10mg/ml）和100μl菌液。然后将96-孔板置于37ºC下恒温培养18~20 h。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。上述实验重复3次，根据实验结果确定各化合物的MIC。