2 材料与方法

2。1 实验材料

半枝莲中药(晒干后,粉碎);灵芝菌;肿瘤细胞:慢性骨髓性白血病细胞(K562),乳腺癌细胞(MCF7),肝癌细胞(Bel-7404)(注:均来源于苏州吴江第一人民医院)

蒸馏水(H2O);葡萄糖(C6H12O6);甲醇试剂(CH3OH);苯酚(C6H6O);浓硫酸试剂(H2SO4);丙酮(C3H6O)。

RPMI1640培养基:用超纯水溶解RPMI1640 10。4 g,再补加碳酸氢钠2g、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL,用7。4% NaHCO3溶液调节pH值至7。0-7。2,滤过0。22 μm 微孔滤膜,于4 ℃冰箱中,保存备用。

胰酶消化液:称取胰酶 0。25 g,用PBS 100 mL溶解,加入7。4% 碳酸氢钠溶液使pH至7。6-7。8,滤过0。22 μm 微孔滤膜(以下简称滤过),于-20 ℃中保管备用。

Alamar blue溶液:称12。5 mg的Resazurin,加入1 L的磷酸盐缓冲溶液中,滤过,放在-80 ℃冰箱,注意避光保存。

2。2 实验设备

电子天平;恒温水浴锅;高压灭菌锅;无菌操作台;破碎机;恒温培养箱;可调控温电热套;旋转蒸发仪;球形冷凝管;移液枪;酶标仪;Agilent 1260 HPLC system,荧光检测器。

2。3 实验方法

2。3。1 样品的制备

2。3。1。1 培养基的配制

称取10g的半枝莲中药两份,置于干燥的锥形瓶中,加入适量的蒸馏水(蒸馏水的量要求全部浸透中药),标号A、B。以麸皮代替半枝莲,按照上述的步骤制成对照组C。三组均密封、标号,再灭菌40分钟,冷却待用。

2。3。1。2灵芝菌的活化

PDA固体培养基灭菌冷却后,倒出适量于培养皿,待干后,接种,待灵芝菌产生菌丝后,挑取适量加到灭菌好的PDA液体培养基中,与26℃摇瓶培养,直到培养瓶中长满了菌球。

2。3。1。3 接种菌种

用破碎机将菌球打碎,将种子液体倒入灭菌后的培养瓶(实验组A、对照组C)中,放在26℃的温度里持续培养60天左右,等菌丝铺满后,持续再培养15天。将三组培养基从瓶中取出(注意将实验组A的菌柄与下面的培养基分开作为两种样品),烘干待用。

2。3。1。4 样品的提取、浓缩

将上述四组烘干的样品,分别倒入圆底烧瓶中,加入适量甲醇[15]使其完全浸没样品。置于可调恒温电热套上,先220伏直热至液体翻滚后,旋转调节至110伏,继续回流提取30min。多次提取,将得到的提取液合在一起浓缩,浓缩至原来的约十分之一即可。取4个样品瓶,标号,将浓缩液倒入标号的瓶子中,静置,待用。

2。3。2 多糖含量的测定(分光光度法)文献综述

2。3。2。1 标准曲线的绘制(苯酚-硫酸法[16])

2。3。2。1。1 显色剂的配制

先配5%的苯酚溶液,再取5ml 5%苯酚溶液,加入25ml的浓硫酸中(此步骤在冰上进行),即可。

2。3。2。1。2 标准品的制备

先采用两步法制成葡萄糖溶液(0。4g/l),再用移液枪依次取0,25,50,75,100,125,150,175,200μL加到9个已经做好标记的EP管中,继续补水定容至200μL,再按顺序加入现制的显色剂,各600μL,混匀。先进行冷水浴,再沸水浴,最后冷水降温,(都是5min),摇匀。

2。3。2。1。3 吸光值的测定

用移液枪从上述的九个样品中各取出200μL葡萄糖溶液放在96孔板中,490nm,测定。

2。3。2。2 样品中多糖的含量测定

取12个EP管,做好标记,用移液枪从步骤1所得到的四个样品瓶中各抽取100μL的上清液,再加入900μL的蒸馏水,这是10^-1的浓度梯度,再按照此法依次配制10^-2、10^-3的浓度梯度。再另外取12个EP管,做好标记,分别加入上述配制的不同浓度的样品液200μL,加入现配的显色剂600μL,摇匀。继续各吸200μL,和上述方法一样进行测定。

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