3。2 验证一抗包被板的效果 18

3。3 四指标新标准品效果验证， 19

3。4 二抗HRP稀释倍数试验 20

3。5 继续测试二抗HRP稀释倍数 22

3。6 测试新标准品冻干后效果 23

3。7 二抗，HRP稀释倍数调整验证 24

3。8 新标准品冻干后效果再次验证 25

3。9 新标准品冻干后最后一次验证 27

4 结论与展望 28

4。1 结论 28

4。2 展望 28

致谢 29

参考文献 30

1绪论

1。1 国内外研究现状

1。1。1 ELISA实验的基本原理

1。1。2 ELISA实验的常见类型有：

1。1。3 ELISA测试试剂准备

1。1。4 ELISA技术目前的适用范围

1。1。5 ELISA技术现在存在的问题

1）由于试剂多为抗原抗体以及酶等有机物质，因而存在时效性，需要提前准备，并且会遇到效价随着时间的延长而降低的问题。

2）试剂半衰期长，应用范围小。

3）特异性取决于其制备时所选用的抗原抗体种类。

1。1。6 ELISA试剂盒

1）ELISA试剂盒简介

ELISA试剂盒，也叫做酶联免疫试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、ELISA Kit、酶联免疫分析试剂盒、ELISA检测试剂盒、酶免试剂盒等，于60-70年代问世后在国内外得打大幅推广。鉴于Elisa生物试验具有敏感性高，特异性强，重复性好等特点，且其试剂稳定、方便保存，易于操作，结果判断较为客观，故而目前ELISA试剂盒已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒一般适用于体外定性检测人、小鼠、大鼠血清或血浆中的抗人类（鼠）相应病毒 IgM 抗体，或者炎症因子一类的ELISA检测。

2）ELISA试剂盒检测原理

ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的多肽抗原包被微孔板板条，将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在抗体，这些抗体就会与多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入IgM- HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长：450nm处测量OD值，按照本IgM抗体ELISA试剂盒的测试标准，OD值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。

3）ELISA试剂盒基本试剂类型

 生化板若干，上面包被有一抗； 标准品冻干粉若干支； 标准品稀释液； 样品稀释液（多为两种，分别稀释血浆及细胞上清液）； 结合物（biotin conjugate）冻干粉（二抗）； 二抗稀释液； HRP（辣根过氧化物酶）； HRP偶联剂（同时也是稀释液）； TMB显色剂，A/B液，1:1混合使用； 终止液； 洗液浓缩液一瓶。

4）ELISA试剂盒基本操作步骤

每种试剂盒因为生产方式，抗原制备，溶液的选择不同，故而操作流程会略微不同，但是大致流程相同，一般如下所述：

 配置标准品； 稀释样品； 于生化板的加样孔中加标准品与样品，上样量一般为50μl或100μl； 用封口膜封好生化板，置于合适温度下孵育，或者过夜（注：孵育是指样品与抗原、抗体、结合物或HRP，在适合的温度下持续反应的过程）； 孵育之后需要倒掉反应孔中的液体，用洗液清晰掉反应孔中的残留液体，然后将孔中剩余洗液拍干； 使用移液枪于反应孔中加入二抗结合物，用封口膜封好生化板之后，在合适温度下孵育一定时间； 孵育之后需要倒掉反应孔中的液体，用洗液清晰掉反应孔中的残留液体，然后将孔中剩余洗液拍干；孵育之后需要倒掉反应孔中的液体，用洗液清晰掉反应孔中的残留液体，然后将孔中剩余洗液拍干； 用移液枪于反应孔中加入一定量的HRP稀释液，用封口膜封好生化板之后，在合适温度下孵育一定时间； 用移液枪于每个反应孔中加入定量的显色液，之后至于暗处，注意观察其颜色变化，以免显色过度，影响读书； 显色完成时，于每个反应孔中加入定量终止液，轻轻摇匀，待颜色变化完成后，到酶标仪上读书，主OD450nm，副OD630nm。