2)ELISA的类型文献综述

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:

 固相的抗菌素原或抗体,即“免疫吸附剂”(immunosorbent);

 酶标记的抗原或抗体,称为“结合物”(conjugate);

 酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型:

3)双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

 加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

 加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。

在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。来:自[优。尔]论,文-网www。youerw。com +QQ752018766-

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。

1。2。4 课题意义

本课题重在探究ELISA 试剂盒的自主开发与实用性改进,在借鉴了国外技术成熟试剂盒的前提下,自主设计,半自主生产自家试剂盒,并在一定程度上改良与调整试剂盒的操作步骤与试验时间,使得试剂盒稳定性与结果准确的情况下,操作更简便,时间更短,以此达到改良试剂盒效果的目的。

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