1。2。3  长链 DNA 和基因组合成技术

（1）长链 DNA 的合成和构建还存在许多的难关。传统的方法是利用限制性酶消化 和连接酶进行组装，近年来采用的则是基于 BioBrick TM[20] 和 BglBrick 的方法 [21] 来 对基因片段进行拼接。这些方法都是基于限制性核酸内切酶的位点序列来进行连接扩增 的，人们一直在努力寻找一种无痕的连接方式，但一直没找到突破口 [22-23] 。还有是一 点很致命的限制条件，就是基因序列往往都存在一种抑制序列使得限制性核酸内切酶无 法下手[24-27]   。

（2）随着 PCR 技 术 (Overlapping extension PCR，OE-PCR)的发展，渐渐实现了 不依赖序列的基因片段的无痕组装。它的主要特点是能够利用同源末端把相近的基因片 段无缝连接，这得益于新型限制酶的出现[28-29] 。除此以外， Clontech®的商品化试剂 盒 In-Fusion[30] 和 USER (Uracil-specific excision reagent   ， ) [31] 以 及 SLIC(Sequence-independent and ligation-independent cloning，)等不用利用基因序列的 克隆方法 [32] 。这些在构建质粒或小基因时效果非常优异，但在长链基因的合成上确远 远不够。这时候出现了操作简单的 Gibson 等温组装法 (Gibson isothermal assembly)这， 该法可以组装长达几百 kb 的基因组水平的片段 [33] 。而对于更长的片段，则采用在酿 酒酵母体内的同源重组法进行拼接则 [35-37]  。

1。3  研究原理

1。3。1 重组质粒转化和抽提实验原理

重组质粒的转化是将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物 转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，以便于后续分子操作。

1。3。2 筛选和鉴定目的克隆的方法

（1）热激法

大肠杆菌在 0℃的 CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促 进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。 在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

（2）电转化法

外加于细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利 于孔 DNA 等大分子进入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它输入细胞也是非常重 要的。

（3）碱裂解法

人们使用碱与 SDS 裂解法从。E。coli 中分离制备质粒 DNA 已经有 20 多年的历史。 将细菌悬浮液暴露在高 PH 值的强阴离子洗涤剂（如 NaOH 和 SDS）中，会使细胞壁破 裂，染色体 DNA 和蛋白质变性，将质粒 DNA 释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配 对完全破坏，但闭环的质粒 DNA 以超螺环节构存在，只要碱处理的强度和时间不要太 过，质粒 DNA 双链仍不会彼此分离。当 PH 值恢复到中性时，DNA 双链就会再次形成。 在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体会相互缠绕成大型复合物， 后者被 SDS 包盖，这些复合物通过离心会从溶液中沉淀下来，这样就可以从上清中回 收复性的质粒 DNA。

在较低 PH 值和高盐浓度环境下，DNA 能与硅胶可逆结合。DNA 双链在较低 PH 值和高盐浓度环境下被硅胶吸附，则以天然状态或部分变性状态存在，不能用洗脱碳水 化合物等生物大分子的溶剂（如 70%乙醇）将其洗脱下来。但是，经过水溶性缓冲液（通 常为 TE 或水）重新水化后，DNA 就能从层析柱上回收。