S.sitiens的再生与遗传转化体系构建(2)
在这项研究中，通过优化植物生长调节剂（PGRs）的组合，建立了以外植体的根、叶和茎为基础的愈伤组织介导的再生和农杆菌介导转化体系。这个方法将促进微体繁殖，种质资源保护和遗传工程。
1. 材料与方法
1.1 材料
S.sitiens(LA1974)的种子由美国加利福尼亚大学番茄遗传资源中心（TGRC）的戴文斯分校馈赠。
1.2 培养准备
1.2.1 无菌苗培养
消毒的种子，播种在加有0.1mg/L GA3，30g/L蔗糖，7.8g/L琼脂（pH5.8）的MS培养基[18]上，在4℃和黑暗的环境下培养4d以打破种子休眠，然后让种子在25℃和黑暗环境下萌发。已发芽的种子被转移到加有30g/L蔗糖和7.8g/L 琼脂（pH5.8）的MS培养基，并保持在25℃与16H/8D的光周期条件中获得无菌幼苗。幼苗的外植体（根、叶、茎）相同的光照条件下诱导愈伤组织。
1.2.2 再生培养基
本试验所采用的再生诱导培养基是在MS的基础上，再加入不同浓度梯度的不同植物生长调节剂。试验中，20mg/L甘露醇和Zt（0.2和0.5mg/L）与IAA（0、0.6、1.2和1.8mg/L）组合的八个浓度的培养基（MS盐、文生素B5、30g/L蔗糖和7.8g/L琼脂，pH5.8）中优化诱导愈伤组织。
1.2.3 转化培养基
悬浮液（MS盐、文生素B5和20g/L葡萄糖、pH值5.8），共培养培养基120mg/L肌醇、0.8mg/L文生素B1、120mg/L KH2PO4、0.25mg/L 2,4-D、0.15mg/L KT和20mg/L甘露醇的共培养基（MS盐、文生素B5、30g/L蔗糖和7.8g/L琼脂，pH5.8），筛选培养基有20mg/L甘露醇、0.2mg/L Zt、1.2mg/L IAA、100mg/L Kan和500mg/L Carb的培养基（MS盐、文生素B5、30g/L蔗糖和7.8g/L琼脂，pH5.8）。
以上各种培养基均需121℃、0.1MPa灭菌17min，备用。
1.3 方法
1.3.1 无菌苗获得
挑选籽粒饱满、均匀的S.sitiens种子，先经75%乙醇进行表面消毒30-60s，无菌水冲洗3次；再经25%次氯酸钠消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。无菌条件下，用灭过菌的竹签将种子播于MS固体培养基上，每瓶5粒种子，于光下培养成苗。分离S.sitiens无菌苗幼苗的根、茎（无腋芽）和叶获得不同类型的外植体。
1.3.2 外植体选择
将S.sitiens无菌苗子叶于无菌水中切成叶被切成约0.25cm2的大小，根和茎被切成约0.5cm长，于无菌吸水纸上吸去多余水分，备用。
1.3.3 细菌菌株、质粒载体和细菌培养
农杆菌介导的遗传转化采用带有pCAMBIA1301质粒的根癌农杆菌菌株GV3101，pCAMBIA1301质粒携带的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因（带有过氧化氢酶内含子）用来检测转化。此外，pCAMBIA1301包含右翼序列，表达序列包括对细菌进行耐药选择Kan耐药基因，挑选植物的Hyg耐药基因和CaMV35S启动子控制的报告基因（GUS），NOS终止子和左翼序列。这种细菌在加有100mg/L Rif和100mg/L Kan的YEB培养基中进行培养。
1.3.4 再生的诱导培养
外植体被放在20mg/L甘露醇和Zt与IAA组合的8个浓度的培养基（MS盐、文生素B5、30g/L蔗糖和7.8g/L琼脂，pH5.8）中优化诱导愈伤组织。长出的芽被分离转移到补充有0.15mg/L a-萘乙酸和20mg/L甘露醇的培养基中使其进一步生长。
1.3.5 转化的诱导培养
在进行共培养之前，将养的根癌农杆菌用悬浮液漂洗几次后离心5000rpm，10min。用悬浮液将收集的菌体均匀的悬浮使悬浮后的吸光度OD600=0.2-0.3。进行共培养时首先将外植体放在看护培养基中，在光周期为16h光和8h黑暗培养看护1d。然后将看护后的外植体泡在含有根癌农杆菌的悬浮液中8-10min，然后放回共培养基上在黑暗下25℃共培养3d。之后再将共培养后的外植体转移到筛选培养基上进行诱导和筛选转基因苗。
1.3.6 对植物组织进行GUS检测
根据已经报道的方法进行GUS组织化学检测[19]。标记农杆菌侵染后再生的植株，分别选取对照植物和标记植株的叶子浸没在GUS染液中，黑暗、37℃处理1d，然后用无水乙醇进行脱色。叶片呈蓝色则证明转化成功。
上一篇：酵母Fes1蛋白与氧化应激的关系
下一篇：响应面法优化富硒平菇发酵工艺条件