响应面法优化富硒平菇发酵工艺条件(2)
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验菌种
菌种：平菇107，周口市农科院提供的菌种。
1.1.2试验试剂
蔗糖，亚硒酸钠，浓硝酸，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na），甲酸，甲苯，3,3'-二氨基联苯胺（DAB），浓氨水，95％乙醇，以上试剂均为分析纯。
1.1.3主要仪器
表1 主要仪器一览表
Table1 main instruments list
仪器名称 生产厂家
LDZX-40KBS立式电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂
SW-CJ-2FD洁净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂
DGF30电热鼓风干燥箱 南京试验仪器厂
荣声BCDR23冰箱 广东省顺德市荣贵区荣贵路
HH-S型水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂
JJ-2组织捣碎机 金坛市杰瑞尔电器有限公司
UV-5100紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司
HWS24电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司
AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
1.1.4培养基
平菇发酵培养基基本成分：棉籽壳80%，麦麸19%，蔗糖1%，pH自然，121 ℃下，2 h[10]。
1.2试验方法
1.2.1硒标准曲线的绘制[11-13]
试验机理：硒元素与3,3'-二氨基联苯胺可以在酸性条件下作用，生成的络合物呈现黄色（Se-DAB）。在pH为7.0～7.5条件下，用甲苯进行萃取，观察有机层显色的程度，在420 nm处利用分光光度计即可测定溶液的OD值。
试验试剂的配制：称取一定质量的亚硒酸钠，加入硝酸溶液（浓硝酸:水=1:30）制成每毫升含硒1.00 mg的溶液，此溶液即为标准硒贮备液；吸取1 mL标准硒贮备液，用硝酸溶液（浓硝酸:水=1:30）定容至100 mL，即为10 μg•mL-1标准硒标准液；0.25 gDAB溶解到50 mL95％的乙醇中，65摄氏度下加热溶解得到0.5%DAB溶液。
硒标准曲线的绘制：分别取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL硒标准液于100 mL烧杯中，然后加水至40 mL。用氨水和甲酸调节pH，使各个烧杯的pH为2～3，加入4 mL 5％的EDTA-2NA溶液，用来掩盖干扰离子。接着加入2 mL 0.5％的DAB溶液，摇匀后置于65 ℃恒温水浴锅中避光反应30 min。取出后用浓氨水调节pH为7.0～7.5，转入分液漏斗中，加入10 mL甲苯萃取，剧烈震荡2 min，静置3～4 min分层，弃水层，将甲苯层通过脱脂棉过滤到试管中待用。最后用分光光度计测420 nm处的OD值，采用甲苯做空白对照。
1.2.2单因素试验
1.2.2.1硒元素单因素试验
将固体培养基按照棉籽壳250 g、麦麸60 g、蔗糖3.2 g的配方进行混匀，配制9份。将系列浓度的Na2SeO3溶液与固体栽培料混匀，制成含硒量分别为0、80、160、240、320、400、480、560、640 mg／kg（以Se计）的培养基。混匀后分别装袋，封口，保证其不漏空气，并分别贴上标签0、1、2、3、4、5、6、7、8。将培养料在高温灭菌锅中以121摄氏度的温度灭菌2个小时。将灭菌的培养基放在超净工作台上，晾12个小时左右，直到其温度降至室温，然后在超净试验台上用镊子进行接种，注意接种量要保持一致。封紧袋子，将其放在阴凉、潮湿的地方，遮光培养。培养至所有的袋子都爬满白色菌丝，将袋口剪开，均匀的洒上水，让其仍然在阴凉的地方生长。每天要在早、中、晚三次洒水，水量不要太多，洒水要均匀。注意观察菌丝的生长情况，每5天测量一次菌丝的长度[14-17]。
平菇生长成熟后，及时采摘，并在每一份平菇中称取20 g，然后加水180 mL进行打浆，用量筒测量浆液体积，分别写上序号。从每份浆液取40 mL倒入100 mL，加入适量的硝酸溶液，调节pH至2-3。后面的操作步骤与绘制硒标准曲线步骤一样。得到每组平菇的硒元素含量的OD值。
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