番茄MPK2基因烟草遗传转化体系的建立(2)
本试验以烟草为试验材料，用GV3101根癌农杆菌介导重组载体的转导，希望能为植物MAPK C族基因的研究作出一定的贡献。近年来，国内外的学者对烟草转化体系的研究已经较为成熟，本试验借鉴已经研究出的结果建立的番茄MPK2基因烟草遗传转化体系期望能对番茄MPK2基因的研究可以对植物MAPK基因功能作进一步诠释奠定一定的基础。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
1.1.1材料
烟草品种珊西、质粒pCAMBIA2301-MPK2、转化受体菌大肠杆菌、GV3101根癌农杆菌等试验材料，均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。
1.1.2主要仪器
琼脂糖凝胶电泳仪；中速离心机；摇床；无菌工作台；PCR仪；分光光度计；pH计。
1.2 试验方法
1.2.1无菌苗的培养
将烟草种子用体积分数75%酒精浸泡30s，用蒸馏水冲洗2~3遍，再用5%次氯酸钠溶液消毒8~10min，用无菌水冲洗3~5次，将种子散播在MS培养基上。待其长出小苗，转移至盛有MS培养基(pH=5.8)的花瓶中，放于25℃，周期为16h的光照，8h的黑暗的组培间中，得到烟草无菌苗，待用。
1.2.2珊西烟草的再生
配制MS+6BA(3 mg/L)+蔗糖3%+NAA(0.2 mg/L)培养基，调培养基pH=6.06。将无菌苗于无菌水中切成1.0cm×1.0cm左右的叶盘直接放于配制好的培养基中，25℃，周期为16h的光照，8h的黑暗的组培间中培养观察再生情况。
1.2.3根癌农杆菌活化
①随机挑取含有质粒pCAMBIA2301-MPK2的GV3101根癌农杆菌单菌落接种于LB添加有25 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的选择培养基中，28℃，240 r/min，过夜摇，至OD600值为0.5左右。
②然后5000 r/min，6min，离心，其沉淀用1/2 MS液体培养基重新悬浮备用。
1.2.4农杆菌感受态的制备及转化
①吸取GV3101根癌农杆菌菌液于YEB中，加利福平100 mg/L，28℃，220 r/min，过夜摇14~16h。
②次日按1:50的比例加入新鲜的YEB中，220 r/min，摇3~4h至菌液OD600值在0.6~0.8之间。
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