拟南芥ABA响应启动子的克隆及驱动报告基因的植物表达载体的构建(3)
1.2.2 启动子简介
在分类上，启动子可分为结构启动子和组织特异性启动子（诱导调控型启动子），前者在有机体中始终处于激活状态。据启动子在转录事件中的调控能力的不同，启动子分为强启动子和弱启动子。在植物生物技术中，所选较高启动能力的结构启动子常常用于大量生产商业蛋白的转基因植物中。为提高植物抗逆能力而改变其代谢途径的生物中，这种启动子也是不可或缺的。启动子通过应答一种或多种基因转录因子（transcription factors，TFs）而调控基因的表达。每个启动子都有其特定的序列结构和结合位点。为了更深入地理解启动子序列结构、转录因子结合位点和基因表达系统网络中启动子调控作用之间的对应关系，必须对启动子的结构作详尽的阐明，并尝试人工合成启动子序列，研究其功能，以期望得到结构和功能的关系。从而实现启动子对单基因和多基因网络复杂表达的特定目的的人工调控，更好地服务于生产。另外，启动子在研究物种进化和物种间亲缘关系方面也发挥了重大作用，作为染色体DNA结构的重要组成部分，同样反映了进化上存在的同源结构和同源功能特征。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达的关键。
1.3 植物表达载体的构建及报告基因
1.3.1 Ti质粒的发展
根癌农杆菌的Ti质粒是迄今为止少数能携带外源DNA插入到植物细胞染色体上的细菌质粒。在已获得的转基因植物中，约80%是由农杆菌Ti质粒介导转化完成的。Ti质粒最初是研究植物冠瘿瘤病时被发现的。1971年，美国科学家通过研究推断，致瘤基因存在于质粒上；1974年，比利时根特大学遗传学实验室的Zaenen专家观察到了农杆菌中巨型质粒，并将其首次命名为Ti质粒。它能从致病植物转移到无病的植株中，是正常的植株致病。1977年，Chilton研究小组分析认为，Ti质粒具有天然转化植物细胞的能力，这一发现极大地激发了人们研究Ti质粒和利用它作为转基因载体的热情。
1.3.2 Ti质粒的结构及功能
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒可分为四个功能区域，分别为T-DNA区（transferred-DNA region），T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来并转移到植物细胞的一段DNA的区域，故被称为转移DNA。T-DNA是Ti质粒中的重要部分之一，既可以使它整合到植物的细胞染色体上，又与肿瘤形成有关。Vir区（virulence region）,Vir区是T-DNA区以外另一个涉及诱发肿瘤的区域，能激活T-DNA的转移，使根癌农杆菌表现出毒性的特征，故被称为毒区。Con区（regions encoding conjugations ），该区段上存在与细菌间结合和转移有关的基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。由T-DNA区产生的冠瘿碱能激活其上的tra基因，诱导Ti质粒转移。Ori区（origin of replication ），Ori区内的基因调控Ti质粒的自我复制功能区域。
1.3.3 Ti质粒的转化机理
根癌农杆菌会感染植物根部的原因为植物根部损伤部位会分泌出酚类物质乙酰丁香酮及羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti质粒上的毒区基因以及根癌农杆菌染色体上的操纵子表达。整个过程大致可以分为以下几个步骤: 根癌农杆菌对植物敏感细胞识别的识别和附着；根癌农杆菌对植物信号物质的感受；根癌农杆菌Ti质粒上的毒区基因以及染色体上的操纵子的活化；T-DNA复合体的产生；T-DNA复合体的转运；T-DNA整合到植物基因中。
1.3.4 植物表达载体的构建
受控于限制性核酸内切酶，起到DNA连接酶及其他修饰酶的功能，分别对目的基因及载体DNA进行一定的切割和修饰后，并将它们连接在一起，从而再导入到宿主细胞内，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达的目的。
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