油菜天然抗性巨嗜蛋白（BnNRAMP）的筛选与基因克隆(2)
引言镉（Cadmium）是环境污染中一种带有剧毒的重金属元素，也是最严重的重金属污染之一，通常来源于磷肥的应用、污水污泥以及诸如镍镉电池、塑料等工厂排放[1]。据统计，在每年近30000吨镉排放中，有超过1/3来源于上述人类活动[3]。早在20世纪70年代，人类镉污染问题就开始引起世界各国的科学家关注 [4]。
镉水溶性高的特点使得镉污染传播广泛，易富集于土壤、农作物及水生生物甚至人体内[2-4]。据报道，虽然镉污染情况的轻重程度带有明显的地域特征，但是全球整体的土壤与草地的镉含量却始终在逐年上升[5]。由于污水灌溉等因素，大量地区种植的农作物也都相继产生严重镉富集现象[6-7]。与此同时，自上世纪50年代日本发现痛痛病以来[8]，越来越多报道指向水生动植物的镉富集问题[9-10]。以水生动物为例，一旦镉元素污染水源，就会逐渐富集在鱼鳃之上[11]，进而通过区域内水生食物链，影响到整个水生群落的健康，最终危害到渔业与人体健康[12]。
镉对人类健康的危害分为急性中毒和慢性中毒[12]。急性中毒会带来粉尘吸入导致的咳嗽、呼吸困难、迟发性肺水肿等呼吸道疾病，或饮食摄入镉含量超标导致的急性肠胃炎等消化道疾病，严重者甚至因此死于呼吸衰竭、循环衰竭。目前更为严峻的是慢性镉中毒问题。若长期摄入含有超标镉元素的饮水和食材，会发生肾损伤、骨质疏松症以及肺损伤等一系列不可逆转的健康问题，严重者甚至因此而死亡[12-16]。
在中国矿产、工业以及农田集中地区，镉污染现象已非常严重 [17-19]。大量研究报道发现，地区性镉污染已严重影响到当地居民的生活健康，大面积诱发包括骨密度降低、肾功能不全等临床疾病[20-21]。有报道证实，福建重污染区婴儿死亡率和早产发生率偏高，恶性肿瘤、呼吸系疾病、消化系疾病及新生儿病的标化死亡率也显著性提高[22]。因此，寻找合适的方法解决目前持续性的环境污染中的镉富集问题显得尤为重要。
为解决上述镉污染问题，世界各地的研究者提出了包括水处理、沸石处理、化学中和、微生物降解以及植物修复等一系列措施[23-25]。其中，植物修复技术具有经济实用、不破坏土壤产能、环境副作用小、文持生态稳定等多项优点[26-27]，更契合于中国镉污染地区经济水平较低、农业依赖度高等特征[28-29]。使用的工具植物必须同时具备可种植面积大、生物周期短以及不影响原本农业价值的特点[30-31]。已有个别报道提出利用具有极强重金属富集能力的甘蓝型油菜作为工具修复土壤镉污染的想法[32]，然而其内在分子机理与实用性尚不为人知。
我们实验室前期miRNA基因筛选研究结果显示，油菜中主要响应重金属镉胁迫的miRNAs的靶基因之一为BnNRAMP1[33-35]，这引起了我们的关注。NRAMP家族全称是天然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins），在包括细菌、植物与动物在内的各种有机体内均有表达，表现出泛二价金属离子转运能力，包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ni2+等[36-38]。对此，本文依据前人对NRAMP家族在其他植物中转运金属离子的研究[39-41]，参考实验室前人对植物中miRNA调控NRAMP金属离子转运蛋白家族的生理数据（未发表），整理了甘蓝型油菜NRAMP家族的进化信息，鉴定了甘蓝型油菜在镉胁迫条件下NRAMP家族的应激情况，并通过PCR克隆出了BnNRAMP1b基因，为之后验证BnNRAMP1b对胞外镉离子的转运等实验提供了材料，也为进一步利用甘蓝型油菜修复土壤镉污染提供了更多的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
油菜特选4号品种：为本实验室保存