拟南芥sasp1突变体对低氮的敏感性分析(2)
拟南芥根系是吸收水分和矿质营养的主要器官，根系的形态、结构与植株中枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶对氮素营养的响应密切相关。SASP1突变型拟南芥是枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶SASP1突变后培养成的拟南芥品种。通过研究拟南芥Col-0野生型和SASP1突变体在不同氮素浓度的环境下，其生长情况、开花时间、根形态和一些生理生化方面的变化, 从而进一步探究拟南芥中枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶对氮素的响应，并利用实验结果尝试如何提高拟南芥的氮素同化能力和提高氮素利用效率[7]。
1材料与方法
1．1实验材料
本次实验采用了Col-0、sasp1-3和sasp1-4三种拟南芥材料，均为本实验室培养。
1．2实验处理
1．2．1消毒和清洗
收取本次实验所需要的三种拟南芥种子，首先使用8%次氯酸钠进行消毒，时间为8分钟，用涡旋机进行涡旋，然后使用离心机离心30秒，转速为5000r以下。清洗种子需要在无菌环境下操作，提前打开超净台的紫外线，其次用70%-75%的酒精进行消毒，然后点燃酒精灯，用1000μl的移液枪吸除次氯酸钠，换枪头后吸取1000μl的无菌水加入离心管中，再依次进行涡旋、离心操作。以上清洗操作重复四次。
1．2．2育苗
配置MS培养基，在超净台里进行点种。点种结束后用密封胶带封好培养皿，放入温室培育。
1．2．3配置营养液
先配置实验所需的母液。
A：KNO330.60g/300ml
CaCl222.20g/200ml
B：MgSO4•7H2O19.60g/200ml
C：KH2PO4 5.40g/200ml
D：EDTA•Na2 1.49g/200ml
FeSO4•7H2O 1.11g/200ml
E：H3BO3 0.57g/200ml
MnCl2•4H2O 0.36g/200ml
CuSO4•5H2O 0.02g/200ml
ZnSO4•7H2O 0.04g/200ml
(NH4)6Mo7O24•4H2O0.25g/200ml
表1 拟南芥培养液母液的成分
A：KNO312ml
CaCl24ml取15ml
B：MgSO4•7H2O 5ml
C：KH2PO4 5ml
D：EDTA•Na2
FeSO4•7H2O 5ml
E：H3BO3
MnCl2•4H2O
CuSO4•5H2O
ZnSO4•7H2O
(NH4)6Mo7O24•4H2O 4ml
表2 9mM NO3-营养液
A：KNO3 1.2ml
CaCl20.4ml 取1.5ml
B：MgSO4•7H2O 0.5ml
C：KH2PO4 0.5ml
D：EDTA•Na2
FeSO4•7H2O 0.5ml
E：H3BO3
MnCl2•4H2O
CuSO4•5H2O
ZnSO4•7H2O
(NH4)6Mo7O24•4H2O 0.4ml
表3 0.9mM NO3-营养液
A：KCl4ml
CaCl2 4ml取7.5ml
B：MgSO4•7H2O 5ml
C：KH2PO4 5ml
D：EDTA•Na2
FeSO4•7H2O 5ml
E：H3BO3
MnCl2•4H2O
CuSO4•5H2O
ZnSO4•7H2O
(NH4)6Mo7O24•4H2O 4ml
表4 0mM NO3-营养液
1．2．4移苗
准备12个暗瓶和孔板，将3个品种长势一致的幼苗从培养基里分别挑出，把根夹入剪成与孔板的孔大小一致的海绵中，然后将海绵塞进孔板，最后将孔板放置在装有各个梯度的营养液的暗瓶中。
1．2．5温室培养
将12个培养皿盖在孔板上，把所有暗瓶放入温室中培养。按照表2、3、4配制营养液并稀释到3L，按NO3-浓度梯度依次更换营养液。每隔两天换一次营养液。在0d和7d的时候拍照记录表型。观察拟南芥生长情况并记录各个品种拟南芥的开花时间。
1．3采样及样品分析方法
将拟南芥从海绵中取出，用吸水纸吸干水分，用电子称称其重量并记录。将拟南芥的地上部分和地下部分分离，分别称重记录。再使用直尺量出各个拟南芥的根长并记录。
测量拟南芥的叶绿素含量：将各个拟南芥样品的地上部分去脉，剪碎，设置三个重复，0.2g/份。加入石英砂和CaCO3粉及2-3ml的95%乙醇，研磨成匀浆，再加10ml的95%乙醇，继续研磨至变白，静置3-5min。取一张干净的滤纸，将它折叠放置于漏斗中，并用95%的乙醇湿润，沿玻璃棒将匀浆倒入漏斗中，过滤至25ml棕色瓶中，用少量乙醇冲洗钵体和玻璃棒。过滤，直至洗至滤纸上无绿色为止，用乙醇定容至25ml并摇匀。用95%的乙醇调零，在波长663nm和645nm下测吸光值。
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