通过荧光基因标记研究苜蓿中华根瘤菌nifH缺失株的竞争定殖能力(2)
要建立豆科植物-根瘤菌共生固氮体系，需要多种相关基因协同表达。在多项研究中发现，诱导根瘤菌结瘤过程的是nod基因，苜蓿根瘤菌中有多拷贝的nod基因，通常认为这种多拷贝为根瘤菌与多种豆科植物共生提供了基础。Nod蛋白通常存在于根瘤菌细胞质中并处于无活性的状态，当接受豆科植物分泌的诱导物质（经鉴定是类黄酮物质）后才开始活化，并诱发结瘤过程。之后根瘤菌开始表达固氮类基因，该类基因分为两类：即nif基因和fix基因，其中nif基因为豆科植物-根瘤菌共生体系进行固氮的必需基因，nifHDK在所有根瘤菌中都存在，但组织结构却存在差异；如在苜蓿根瘤菌和豌豆根瘤菌中，nifHDK自成一个操纵子，而在大豆根瘤菌中则为两个不连锁的操纵子nifH和nifDK[5]。并由nifA基因统一调控两个操纵子的表达[6]。苜蓿根瘤菌固氮酶是由nifHDK基因编码的钼铁蛋白和铁蛋白组成，。其中nifH是铁蛋白的结构基因。nifH的缺失会导致根瘤菌固氮酶活性丧失，进而使得共生体系不能固氮。同时在nod基因和类黄酮物质的诱导下，△nifH根瘤菌菌株依然会完成信号交流并形成根瘤。从植物体内获得生长所需的资源，却无法为植物提供氮素，这就使得这种缺失固氮能力的根瘤菌和植物间的共生关系类似于一种寄生关系，这类缺失突变株可被看作欺骗株。
本实验拟通过对根瘤菌2011菌株及△nifH固氮酶缺失突变株进行标记，然后接种苜蓿，观察两者的定殖情况，通过差异分析苜蓿-苜蓿中华根瘤菌共生体系宿主制裁的情况。对根瘤菌的标记通常有两种方法，分别是遗传标记法与基因标记法。[5] 遗传变异是通过对生物体内受基因控制的可变异遗传性状进行有效的度量和观察，从而达到研究目的。在根瘤菌分子生态学及结瘤研究中，常用的遗传标记方法有内源抗生素法、荧光抗体法、黑色素法。[6] 但是这些技术常常是工作量大而且检测技术要求高，同时存在背景干扰的问题。[7] 基因标记技术是指选用有方便检测的生理功能的基因做标记的技术，常用的报告基因有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、β-葡萄糖苷酶基因（gus）、发光酶基因（luxAB）、荧光蛋白基因等。通常这些基因具有发光、颜色反应、抗药性等便于检测的特性。由于其他基因在应用于豆科植物根瘤菌共生体系检测时多少存在发光活性弱、内源背景干扰不易消除等问题，同时荧光蛋白基因具有广谱性、荧光强度强，便于检测，耐受光漂白以及无内源背景干扰的优点，所以最终选用使用荧光蛋白基因gfp基因与rfp基因作为本次研究苜蓿-苜蓿中华根瘤菌共生体系的标记基因。
通过对苜蓿-苜蓿中华根瘤菌体系竞争定殖和宿主制裁的研究，可以让我们更好地理解该共生体系的限制和特性，对根瘤菌筛种、苜蓿品种培养以至于农业牧草增产都大有裨益。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
2011菌株：苜蓿中华根瘤菌野生菌株；
△nifH菌株：苜蓿中华根瘤菌2011菌株的固氮酶基因缺失突变株；
DH5α：大肠杆菌菌株，常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
SM10 λpir：大肠杆菌菌株，Genr，含有sacB基因，该菌株在蔗糖平板难以生长，可用于检测双交换菌株。
1.2 培养基与培养条件
大肠杆菌用 LB 培养基，于 37℃下培养；根瘤菌用 PY 培养基，于 28℃下培养；
根瘤菌蔗糖敏感性验证与质粒消除用 PY 加 10%蔗糖的培养基。
PY培养基配方：蛋白胨：3 g，酵母提取物：1 g， CaCl2 ：1 g， 定容至1L
LB培养及配方：蛋白胨：10g, 酵母提取物：5g, NaCl：10g，定容至1L