AGAROSE G-10 琼脂糖

HiFi-Script cDNA 第一链合成试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司

DH5α Competent Cell 大肠杆菌感受态细胞，购于康为公司

pMD18-T vector 质粒 购于 Takapa 公司

2。1。3 实验材料

华鳈取自洪泽湖

2。2 实验过程

2。2。1 华鳈 Sox9 引物设计

根据已有的鱼类 Sox9 基因的信号肽，找出它的保守序列，设计简并引物，引物由生 工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

表 1 本研究所用 Sox9 基因引物信息

引物名称 上游引物 下游引物 退火温度（℃） 片段长度 (bp)

Sssox9a-1 AGACACCAGC CACCCTCGTT 55 345

AGAAACACTC CAGTAATCTC

C C

Sssox9a-2 CCACCACCCC GACTGAGGGA 60 604

来自优I尔Y论S文C网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766 ACTGAC TGGAAGGAAC

C

Sssox9aIn1-1 AATACCCGCA CGTTCTTCAC 55 177

CCTCCACA CGACTTCCTC

Sssox9aIn2-1 CACCCCGACT CTTCAGATCC 57 252

ACAAGTATCA GCTTTGCCT

G

2。2。2 华鳈 RNA 的提取

取一条华鳈，将其麻醉，分别切取皮肤、肌肉、肾脏、精巢、脾脏、肠、心脏、中脑、 下丘脑和垂体这 10 个部分各 50 mg 左右的组织，迅速地加入 500 uL TRIzol Reagent 提取 液的 2 mL 的 EP 管中，用匀浆器将样品彻底匀浆，该过程在冰上进行。匀浆后在室温下放 置 5 min，目的是彻底分裂核蛋白复合体。随后加入 0。1 mL 氯仿剧烈摇晃 15 s，充分混合后，室温静置 2-5 min。文献综述

12000 r/min 于 4 ℃离心 15 min，离心后分三层，底层为红色有机相，中间层为蛋白， 上层为无色水相，其中 RNA 主要存在于水相中，水相体积约为所用 TRIzol 的 60 %。将无 色水相取至另一只无 RNAase 的 1。5 mL EP 管中，加入 0。25 mL 异丙醇，混合静置 10 min。 12000 r/min 于 4 ℃离心 10 min，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

倒掉上清，加入 0。5 mL 75％乙醇（375 μL 无水乙醇和 125 μL DEPC 处理的无菌水） 洗涤，能看见白色片状沉淀，9000 r/min 于 4 ℃离心 5 min，尽可能地倒出废液，空气干燥 5-10 min，此过程在 RNA 操作台上进行，加无 RNA 酶水（25-200 μL）溶解 2-3 小时。

用无 RNA 酶枪头吸取 1 μL RNA 在 D2000 分光光度仪上测定其浓度以检测 RNA 质量。 检测合格的 RNA 可立即用于 cDNA 的合成或放置−80 ℃冰箱保存待用。