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电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 DKZ-1

孵化机 德州市科裕孵化设备有限公司 KFV

2。5 实验动物

实验动物 来源

SPF鸡蛋 国药扬州威客生物工程有限公司

3 实验步骤

3。1 SPF鸡的准备

    从国药扬州威客生物工程有限公司引进一批SPF鸡蛋,在孵化机中37。2℃,70%RH孵化21天。待小鸡破壳后继续置于孵化机之前状态培养,以待小鸡羽毛上水分蒸干。12h后将小鸡转到鸡舍中培养至1日龄以备实验。

3。2 LB培养基中细菌的培养

从-70℃冰箱取出保存的APEC E1株,并将其接种于LB液体培养基中,于37℃静置培养至对数生长期(OD600=0。4~0。8)。

3。3 鸡血中细菌的富集和分离论文网

将5只1日龄SPF鸡(108CFU/只)左胸气囊接种APEC E1,分别在5小时和18小时后采血两次,每次共采血7mL,将血液3000rpm离心5min后,再将上清转移至新的离心管,在室温下12000rpm离心2 min,去上清,将剩余菌体沉淀于液氮中速冻10 min,而后转移到-80℃冰箱中保存待用。

3。4 RNA的提取

2。4。1传统法提RNA

2。4。1。1 鸡血清中细菌RNA的提取

将不同时间采血分离到的细菌从-80℃冰箱中取出,在室温下溶化,先后加入400μL的TES液、400μL的水饱和酚,剧烈振荡混匀,之后置于65℃水浴锅中加热1 h,期间每隔10 min剧烈振荡一次;而后至于冰盒冰浴5 min, 在高速冷冻离心机4℃、12000rpm下离心5 min;将水相转移至一新的1。5 mL灭菌离心管中,加入等体积氯仿抽提一次,置于高速冷冻离心机4℃、12000rpm 离心5 min;再将水相转移至一新1。5 mL灭菌离心管中(约400μL),加入1/10体积的DEPC水配制的NaAc(3 M,pH5。2)及2。5倍体积的无水乙醇,置于-20℃ 冰箱静置30 min;高速冷冻离心机4℃、12000rpm离心10 min,用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀,室温放置5min晾干,加入50μL DEPC水,在65℃水浴锅加热15 min充分溶解RNA沉淀。

3。4。1。2 LB培养基中细菌RNA的提取

将APEC E1株在LB培养基中静置过夜培养后按上述传统法提RNA。

3。4。2RNAiso plus试剂盒法提RNA

3。4。2。1 鸡血清中细菌RNA的提取

从-80℃冰箱取出保存的菌种,取1ml菌液于1。5ml离心管,12000rpm离心2min后弃上清,在离心管中加入1ml RNAiso plus 反复吹打至无明显沉淀,室温下静置5min后,加入200ul氯仿剧烈震荡15s,待管内液体充分乳化后,室温静置10min,12000rpm离心5min,将上清转移至一新的1。5 mL灭菌离心管,加入等体积的异丙醇上下颠倒混匀,室温静置10min,12000rpm离心10min,小心弃去上清液,沿管壁加入DEPC水配制的75%乙醇,上下颠倒洗涤管壁,12000rpm离心5min后弃上清,吸去残液,室温干燥5min加入50μL RNase Free dH2O,充分溶解沉淀[4]。

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