摘 要： 将纤维素高效廉价的转化为可发酵的单糖是生物燃料工业生产的关键瓶颈。研究显示作为工业生产纤维素酶的主要菌株，里氏木霉的β-葡萄糖苷酶在其纤维素酶的整体酶活及其诱导表达中起到了双重关键作用。本实验主要研究以里氏木霉RutC-30为研究对象，通过研究β-葡萄糖苷酶Cel3c对纤维素酶基因表达及其酶活的影响，从而分析出β-葡萄糖苷酶Cel3c在里氏木霉诱导表达过程中的作用机理。在前期的工作中，通过克隆已构建出了含潮霉素抗性基因的双元载体，并转化到根癌农杆菌获得了转化菌株。本实验中采用根癌农杆菌介导的转化方法实现了β-葡萄糖苷酶cel3c基因到丝状真菌里氏木霉的遗传转化，并采用PCR扩增对转化子中的插入片段进行鉴定。为后续的酶活测定奠定基础。93571

毕业论文关键词：农杆菌，转化，里氏木霉，鉴定

Abstract： The conversion of cellulose with high efficiency and low cost for fermentable monosaccharide is the key bottleneck for biofuel production。 Current research has shown that β-glucosidase form Trichoderma reesei, the main stain for cellulase production, plays a key role in the overall cellulase activity and induced expression of cellulases。 Here, we propose to study the expression changes of cellulase gene cel3c and cellulase activity after overexpression of β-glucosidase gene cel3c in Trichoderma reesei Rut-30。 Thus, through an analysis of above results, an induction mechanism of cellulase gene by β-glucosidase gene cel3c in T。 reesei can be deduced。 Before this experiment, the binary vector containing the hygromycin phosphotransferase (hph) gene was constructed based on a commercial vector, and was transformed into A。 tumeficiens。 In this experiment, transformation of the filamentous fungus form β-glucosidase gene cel3c to T。 reesei was achieved using Agrobacterium tumeficiens-mediated transformation (ATMT) method。 The DNA fragment that was inserted into the fungal transformants was identificated through PCR amplification。 This research will lay a foundation for determination of cellulase activity in the later experiment。 

Keywords： Agrobacterium, transformation, Trichoderma reesei, appraisal

目   录

1 前言 3

1。1 实验背景 3

1。2 纤维素及纤维素酶 4

1。2。1 β-葡萄糖苷酶的细胞定位 4

1。2。2 β-葡萄糖苷酶的作用机理 5

2 实验内容 6

3 农杆菌 6

3。1  农杆菌的转化机理 6

3。2 农杆菌介导真菌转化的特点 8

4 实验材料 8

4。1 材料 8

4。2 试剂 8

4。3 培养基 9

5 实验方法与具体过程 9

5。1 T。reesei转化受体的准备 9

5。2 农杆菌的准备 11

5。3 里氏木霉和农杆菌的共培养 12

5。4 转化子的鉴定 13

5。4。1 PCR扩增的原理 13

5。4。2 PCR鉴定过程 13

5。4。3 PCR鉴定结果 14

5。4。4 结果分析