2。3。8  Azo600纯化 8

2。3。9  酶活性检测 8

3  结果与分析 8

3。1  金橙II降解菌株总DNA的提取 8

3。2  疑似基因的PCR扩增 9

3。3  PCR产物TA克隆验证 9

3。4  金橙II降解酶基因序列分析 10

3。5  基因片段及表达载体片段的酶切回收 11

3。6  表达载体pET29a-azo600构建 11

3。7  重组表达载体pET29a-azo600的诱导表达及SDS-PAGE分析 12

3。8  Azo600纯化 12

3。9  酶活性检测 13

附 录1 15

附 录2 16

参考文献 17

致谢 18

1  前言来自优I尔Q论T文D网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

金橙II，属于偶氮染料，偶氮染料是含有一到数个偶氮键的有机合成染色剂，应用广泛已被广泛的应用于纺织印染、印刷、药品与食品加工等工业中[1]。但是金橙II的化学性质稳定，被认为是持久性污染物，因为排放到自然环境中后会不断的蓄积，在蔬菜、水源和土壤中残留积累，最终会通过食物链威胁人类的健康。据研究，金橙II存在潜在的致癌,会被肠道细菌分解成芳香胺，这些芳香胺是强诱变剂或致癌剂[2]。

染料在环境中的的降解主要有物理、化学和生物三条途径。国内外对细菌降解偶氮染料的研究越来越多，分离到的偶氮染料降解菌有Rhodopsedomonas palustris[3]、Pseudomonas luteola [4]、Septococcus Faecalis I[5]、Sphingomonas sp。[6]、Proteus vulgaris[7]、Pseudomonas sp。 [8]但针对金橙II的降解研究较少，邓月[9]等人利用氧化铁I彭润土的制备及其类Fenton催化降解金橙Ⅱ,而邵鲁华[10]等人利用赤泥基非均相催化剂类Fenton催化降解金橙Ⅱ，同时车寅生[11]等曾研究过金橙II的光催化降解，而金橙II在环境中主要是通过生物降解，因此，因此，分离筛选出能高效降解金橙II的菌株是解决金橙II污染环境及环境修复的关键所在。

目前国内外仅有较少篇有关偶氮染料降解基因-酶的报道。杜翠红等从偶氮染料脱色菌株AZR的基因组中扩增出偶氮还原酶基因AZR，其大小为567bp，编码188个氨基酸。并且Silke Blumel也从菌株Xenophilus azovorans KF46F的基因组中扩增出偶氮还原酶基因azoB，该基因编码281个氨基酸的蛋白质，其分子质量30278 Da。而现今，针对金橙Ⅱ降解基因-酶的研究更少。

本文以金橙II高效降解菌株AO7-3为研究材料，克隆了金橙II降解酶基因azo600，并构建了该基因的大肠杆菌异源重组表达菌株，表达和纯化了金橙II降解酶，在此基础之上，初步研究了该酶的特性。本文阐明了菌株AO7-3降解金橙II第一步降解反应在基因和酶水平上的分子机理，丰富了金橙II降解基因-酶的资源库。从酶以及基因水平上阐明菌株降解金橙II的分子机理可为菌株进行稳定性遗传改造及环境修复提供参考。

2  材料与方法

2。1  供试菌株和试剂

试剂：金橙II染料、氨苄抗生素、卡那抗生素、蛋白酶K等，研究所需其他溶液见附录2。

供试菌株：金橙II高效降解菌株AO7-3，该菌为本实验室在前期研究中从染料废水处理系统的活性污泥中分离获得。