酶切鉴定：取重蒸水5μL，上述提取质粒DNA 3μL，10×H Buffer 1μL，XhoI酶0。5μL，NdeI酶0。5μL，置于37℃培养3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测分析提取的质粒DNA是否含目的基因。

2。3。3  金橙II降解酶基因序列分析 文献综述

将提取的阳性转化子的质粒DNA送测序公司测序，用软件BioEdit进行编辑分析基因序列，将测序结果提交到美国生物技术信息中心数据库NCBI（http://blast。ncbi。nlm。 nih。gov/）中进行核酸的Blast比对。

2。3。4  金橙II降解酶基因重组表达载体pET29a-azo600构建

基因片段及表达载体片段的酶切回收

分别提取质粒pMD18T-azo600和表达载体pET29a，同时用限制性内切酶NdeI和XhoI处理这两个质粒。切胶回收基因azo600片段和线性化的表达载体pET29a片段。

酶切体系（10μL）：重蒸水：5μL，质粒pMD18T-azo600或pET29a：3μL，10*H缓冲液Buffer：1μL，XhoI酶：0。5μL，NdeI酶：0。5μL，37℃培养3h。

表达载体pET29a-azo600构建

将基因azo600片段和线性化的表达载体pET29a片段16℃过夜酶连。

酶连体系(10μL)：重蒸水3。5μL，基因azo600片段4μL，载体pET29a片段1μL，T4连接酶0。5μL，T4连接酶10×Buffer 1μL。