无机盐固体培养基:无机盐液体培养液,琼脂 1。5%~2%。

2。3  研究方法

2。3。1  金橙II降解酶基因的克隆

通过查阅文献比对分析,将疑似的ORF用PCR 扩增并克隆到pMD-18T载体上,转化到大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)中,进一步验证其金橙II降解活性。

菌株总DNA的制备:

采取高盐法提取菌体总DNA:接种菌株至100mL的LB液体培养基中,30℃振荡培养。12000g离心1min收集菌体,加等体积的TE(pH8。0)洗涤并重悬菌体于10mL TE中,加溶菌酶至100μg/mL,37℃水浴至体系澄清。加终浓度2%SDS,加蛋白酶K至100μg/mL,37℃水浴过夜。加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡15秒。等体积酚:氯仿:异戊醇反复抽提,12000 r/min离心10min,至无白色界面。转移收集上清,加0。6倍体积异丙醇沉淀,毛细管捞出絮状沉淀,70%乙醇洗涤沉淀,乙醇挥发后溶于200μL TE(pH8。0)中,保存备用。

疑似基因的PCR扩增:

引物设计:

以已知报道的基因来设计引物,并在引物上分别加入了NdeI和XhoI限制性酶切位点以方便克隆和表达载体的构建。

azo888F:GGAATTCCATATGAAGAACAAGAAGCCCCA

azo888R:CCGCTCGAGGTAGGCCAGCTTGTCACGGT

PCR反应体系(50μL):10×PCR buffer(含Mg2+)5μL,dNTP 4μL,引物各1μL,模板DNA 1 μL,Taq酶(5U/μL)1 μL,重蒸水38μL。

反应条件:94℃预变性5min,94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1。5min,30个循环,72℃保持10min。

2。3。2  PCR产物TA克隆验证

将PCR产物与T载体16℃过夜酶连。

酶连体系(10μL):重蒸水3。5μL,PCR产物4μL,pMD18-T载体1μL,T4连接酶0。5μL,T4连接酶10×Buffer 1μL。

E。coil DH5α菌株感受态细胞制备与转化文献综述

从-70℃冰箱中取出用甘油保存的菌株E。coil DH5α于固体LB平板上,37℃过夜培养。待长出菌落后,用接菌环挑取单菌落于100mL液体LB三角瓶中,37℃于摇床上200r/min振荡培养至OD600为0。5左右。4℃条件下,6000r/min,离心5min以获得菌体。用10mL TSB重悬菌体,并于冰上放置10min,分装后于-70℃保存。

取酶连产物10μL,5*KCM溶液10μL,无菌水30μL置于放在冰水浴中的1。5mL离心管中。从-70℃冰箱中取出感受态E。coil DH5α立即融化,取50μL加入上述1。5mL离心管中轻轻吹吸混匀。放置冰水浴中20min后,在室温下再放置10min。加入500μL液体LB,置于摇床上,37℃条件下150r/min振荡培养50min复苏。然后在6000r/min离心2min浓缩菌体涂布氨苄平板筛选。

阳性转化子筛选

质粒DNA的小量提取:将筛选到阳性转化子扩大培养后,取1。5mL菌液,12000r/min 离心1min,用TE重悬洗涤离心1~2次。取菌沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。加200μL新配制的溶液II,室温下放置3~5min。加150μL用冰预冷的溶液III,冰上放置5min。12000r/min离心5min,将上清转移至另一离心管中,加2倍体积的冰无水乙醇,颠倒混合,于室温下放置5~6min使质粒沉淀。12000r/min离心5min,弃去上清液,将离心管倒置于吸水纸上,待所有液体流出后,用1mL 70%乙醇洗涤2次并风干沉淀。待离心管中质粒变透明后,用40μL TER溶解质粒,-4℃待用。

酶切鉴定:取重蒸水5μL,上述提取质粒DNA 3μL,10×H Buffer 1μL,XhoI酶0。5μL,NdeI酶0。5μL,置于37℃培养3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测分析提取的质粒DNA是否含目的基因。

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