Drosophila Drosha的克隆与表达(2)
本实验采用的克隆载体为TaKaRa公司的T-Vector pMD19(simple)。它是两侧的3’端添加了“T”的线性化载体，因为大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性。因此，pMD19和基因片段连接很容易，转化效率也很高，适合作为克隆载体。
1.1.2.2 表达载体
本实验采用的表达载体为艾德莱公司的拓扑异构酶载体pTOPO-T simple Vector。它与传统的T4连接酶原理不同，利用了Topoisomerase可以在瞬间（几秒钟-几分钟）、高效（接近100%）连接DNA片段的原理制成。转化效率没有TA载体高，但具有完整的启动子和终止子，故选作表达载体。
1.1.3 感受态细胞
本实验中采用的感受态细胞为E.coli。
1.1.4 细胞
本实验采用的细胞为人的293T细胞。293T细胞源自于293细胞株，是插入了猿类免疫缺陷病毒SV40大T抗原基因后产生的高转染效率的衍生株，该细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。该细胞在37℃、5%CO2、无菌恒温培养箱的条件下培养。293T细胞的增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。
1.1.5 引物
本实验中用到的引物一共有三对，分别是A77-Q88-5’（生工）、A77-Q88-3’（生工），Hind3-dDrosha-5’(Invitrogen)、shaP210-T221-3’（生工），T221-K-230-5’（生工）、a-BsmBⅠ1410-3’（生工）。引物序列见附录1。
1.2 实验方法
1.2.1 质粒提取
本实验中的质粒提取采用BIOMIGA公司的质粒提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit提取质粒。用标准LB（Luria Bertani）培养基培养大肠杆菌12-16h至菌液OD600（细菌密度）值在2.0-3.0之间，取5ml菌液于12ml细胞管中，室温4000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入250μl含RNase A的 Buffer A1，涡流震荡悬浮细胞，转入2.5ml离心管中；加入250μl Buffer B1，轻轻地反转10次以混合均匀，静置5min至溶液粘稠而澄清；加入350μl预冷后的 Buffer N1，立即反转多次至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，室温下13,000rpm离心10min至沉淀完全；小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中（避免吸起沉淀），室温13,000rpm离心1min，弃废液，将离心柱重新放回到收集管中；向离心柱中加入500μl 含无水乙醇DNA Wash Buffer，室温13,000rpm离心1min，弃废液，将离心柱重新放回到收集管中，重复1次；13,000rpm室温开盖离心5-10min以彻底去除残留的乙醇；将离心柱转至一个新的1.5ml离心管中，向DNA柱中加入70μl Elution Buffer，室温放置2min，13,000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。将洗脱液再次加入到柱中，13,000rpm离心1min，收集洗脱液。
1.2.2 制备感受态细胞
将大肠杆菌接入3ml LB液体培养基，37℃恒温摇床中以180rpm的转速摇过夜；转入150ml LB培养基中37℃转化2h；当菌液的OD600达到0.5左右时，将菌液分装进4个50ml的离心管中；将离心机的温度调节到4℃,4000rpm离心10min，抽去上清留沉淀；每管中加入7ml 0.1M的MgCl2溶液，混合均匀，冰上放置15min，合成一管；将离心机的温度调节到4℃,4000rpm离心10min，抽去上清留沉淀；加入5ml 0.1M的CaCl2溶液，混合均匀，转入15ml的离心管中，冰上放置1h，每15min混匀一次；加入70%甘油至终浓度为15%，分装到1.5ml的离心管中，-80℃保存。
1.2.3 连接
往灭过菌的1.5ml离心管中加入0.5μl载体（pMD19或pTOPO-T simple Vector）、5μl 2×Ligation Mix、4.5μl 待连接的DNA片段，在振荡器上混匀，轻轻离心使离心管盖上和管壁上的溶液全部落入管底，室温放置30min。
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