Drosophila Drosha的克隆与表达(4)
转染是将DNA片段插入细胞或细胞系的过程。本实验中利用转染的技术，将构建好的pTOPO-Drosophila Drosha基因转入293T细胞中，以检测该基因是否能够正常表达。转染试剂为Invitrogen公司的Lipofectamine 2000 Transfection Reagent。实验中，将DNA加入50μl无血清的DMEM培养基中，将1μl的lipo2000加入50μl无血清的DMEM培养基中混匀，室温下放置20min，一滴一滴加入细胞培养液。37℃恒温无菌培养箱中培养48h后提取蛋白。
1.2.11 Western Blot
培养好的细胞用PBS清洗后加入NETN裂解液，离心取上清；清洗SDS-PAGE电泳槽，加入配置好的分离胶和浓缩胶，插入梳齿；待胶凝固后拔下梳齿，加入缓冲液，点样；当溴酚蓝刚跑出时即可停止电泳，将胶小心取下，放入浸泡在缓冲液中的NC膜上，中间用滤纸隔开，排气泡，扣上转移槽上盖，用400mA电流转膜35min；将NC膜取出，用去离子水清洗，浸入丽春红染色5-10min，再用去离子水清洗2-3次；将3g脱脂奶粉加入30ml TBST（1×）溶液中混匀，让NC膜完全浸泡在脱脂奶粉溶液中10-15min，用TBST（1×）溶液清洗三次NC膜，每次5min；覆一抗αFlag和αactin 1-1.5h，用TBST（1×）溶液清洗三次NC膜，每次5min；覆二抗AP标记1h，用TBST（1×）溶液清洗三次NC膜，每次5min；用去离子水清洗NC膜，选用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色法显现出蛋白条带。
2 结果与分析
本实验共分为两个部分。第一个部分为Drosophila Drosha的克隆：将带有突变的Drosha分片段设计引物并克隆出正确的序列，连接到克隆载体上测序；确定序列正确后，用PCR手段将Drosha片段合成一个整体，并连接到表达载体PTOPO上得到完整的Drosophila Drosha克隆。第二个部分为Drosophila Drosha的表达：将克隆完成的Drosophila Drosha基因转入人的293T细胞进行表达，用Western Blot确定蛋白表达成功。
2.1 Drosophila Drosha的克隆
本实验中Drosophila Drosha的克隆根据载体的类型共分为两个阶段。第一阶段的实验目标为将几个短的基因片段通过PCR的方式连接到一起，因此选用了克隆效率高的TA载体作为克隆载体；第二阶段的实验目的为Drosophila Drosha蛋白表达的准备，因此选用了具有完整启动子和终止子的载体pTOPO作为表达载体。
2.1.1 分段克隆Drosha基因片段
本实验的实验材料为实验室以前构建好的但是仍然带有突变的Drosha基因，且Drosha基因较长，因此我们采用分段克隆Drosha基因片段的方式将突变修复。本实验采用分段修复的方法，第一步将450bp左右大小的Drosha片段（片段1）与270bp左右大小的Drosha片段（片段2）进行连接，成为700bp左右大小的Drosha片段（片段3）。通过核酸电泳和基因测序来验证所得片段是否正确。电泳结果见图2.1.1，由图可知，PCR结果为700bp左右的核酸片段（片段3），序列见附录2，经过Blast鉴定，片段3为Drosophila Drosha。
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