1。3生物法

由于偶氮染料自身的可生化性效果不好，传统的方法无法彻底地将偶氮染料降解，并且降解后的产物具有较强的毒性。因此，人们正在寻求更有效、更彻底、更安全、更廉价的方法，由于生物法二次污染小，处理费用低，是目前较普遍使用的方法。生物法前些年的研究主要集中在对优良脱色微生物的培育、筛选上。微生物用于降解、转化物质有如下优势[13]:微生物繁殖快，易变异，适应性强，代谢速率快;种类繁多，分布广泛，代谢类型多样;降解酶专一性强，且很多酶是在污染物质方面有着巨大的潜力。利用优良脱色菌株或菌群脱色染料是染料降解的一个重要发展方向，具有重要的现实意义。己经发现很多微生物都能使染料脱色，主要分布在真菌和细菌[14]。

2 材料与方法

2。1供试菌和试剂

试剂：偶氮染料金橙Ⅱ，其余试剂为国产试剂（分析纯）

供试菌：染料废水处理系统的活性污中筛选得到的菌株AO7-1

2。2 培养基源C于H优J尔W论R文M网WwW.youeRw.com 原文+QQ752-018766

(1)富集培养基: 蛋白胨2。0 g/L、牛肉膏3。0g/L、葡萄糖5。0 g/L、KH2PO4 1。8 g/L、NaH2PO4·12H2O 3。5 g/L、MgSO4·7H20。2 g/L、FeCl3·7H2O 0。01 g/L、MnSO4·7H2O 0。02 g/L、金橙II 0。04 g/L,pH 7。0。

(2) 分离培养基: 蛋白胨2。0 g/L、牛肉膏3。0g/L、葡萄糖5。0 g/L、KH2PO4 1。8 g/L、NaH2PO4·12H2O 3。0g/L、MgSO4·7H2O 0。2 g/L、FeCl3·7H2O 0。01 g/L、MnSO4·7H2O 0。02g/L、金橙II 0。04 g/L、琼脂20 g/L，pH7。0。

(3)染料培养基：蛋白胨2。0 g/L、牛肉膏3。0g/L、葡萄糖5。0 g/L、KH2PO4 1。8 g/L、NaH2PO4·12H2O 3。0g/L、MgSO4·7H2O 0。2 g/L、FeCl3·7H2O 0。01 g/L、MnSO4·7H2O 0。02g/L、金橙II 0。01 g/L、琼脂20 g/L，pH7。0。[15]

(4)LB培养基: 蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7。0。（固体加15g琼脂）

2。3 实验方法

2。3。1 偶氮染料金橙Ⅱ脱色降解菌的富集与分离

取染料废水处理系统的活性污1g加入少量的无菌水混匀，随后吸取5mL水样并加入到含有50 mL富集培养液的三角瓶中，于30℃静置培养直至肉眼观察到染料基本脱色完全为止。随后再吸取5 mL降解液加入至50 mL新鲜富集培养基中继续驯化培养直至染料的完全脱色。最后，在超净台上吸取染料降解液0。 1 mL，用无菌水将菌液稀释成10-1-10-7并涂布于固体平板分离培养基上，于30℃静置培养。最后，挑取菌落进行划线分离，直到平板上出现单一菌落为止并挑于-20℃保藏。

2。3。2 菌落形态及菌株显微观察

在LB固体培养基平板上划线接种，放入恒温箱37℃培养24h,观察菌落形态。用接种针在平板上挑取少许降解菌，放到事先滴有水的载波片上烤干，简单染色后用油镜观察。

2。3。3 菌株16S rDNA的扩增与序列分析

采取SDS高盐沉淀法提取菌体总DNA。挑取LB平板上的单菌落，接至100mL的LB液体培养基中扩大培养。离心收集菌体，加等体积的TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于10mL TE中，加入100μl溶菌酶（100mg/ml），37℃水浴1h，加入40μl蛋白酶K（20mg/ml），再加入300μl 20%的SDS，37℃水浴过夜（约12h）。加入1/2体积饱和NaCl剧烈振荡，12000 g离心10min，上清用等体积酚：氯仿抽提2次，12000 g离心10min，收集上清，加入等体积TE（稀释调整NaCl浓度），0。6倍体积异丙醇沉淀，12000 g离心15 min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于100μl TE中。

以纯化后的DNA为模板，采用细菌16SrDNA序列的通用引物:上游5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3',下游5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3',进行PCR扩增。PCR反应体系25μL，其中10 x PCR Buffer 2。5μL,dNTP 2。0μL上、下游引物各0。5μL，菌株DNA1。 0 μL Tag DNA聚合酶0。 5 μL其余为ddH2O，反应条件:94℃变性3 min ; 94℃变性50s，55℃复性50s，72℃延伸1。 5 min，共30个循环;72℃延伸10 min。PCR扩增产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序。