REK重组大肠杆菌的发酵优化(2)
3. 结果与分析 8
3.1 REK大肠杆菌鉴定结果分析： 8
3.2 重组大肠杆菌发酵结果及控制方法 9
3.3发酵二级种子接种量优化结果分析 10
3.4 发酵温度的优化结果分析 11
3.5 发酵pH值优化的结果分析 12
3.6 发酵诱导时间优化的结果分析 13
4 讨论 14
5 致谢 14
参考文献 15
引言
肠激酶（enterokinase，EK，EC3．4．21．9．）是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶，可沿胰蛋白酶原序列中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-的羧基端切下，从而释放出活性胰蛋白酶，此反应要比由胰蛋白酶自身触媒引起的活性化快数十倍，几乎所有被定序的胰蛋白酶原都被发现具有4个天冬氨酸相连的结构特征，Asp-Asp-Asp-Asp-残基的强大负电荷降低了这个位点被胰蛋白酶原自切割的可能性，而肠激酶活性中心有一个特殊的阳离子位点，Asp-Asp-Asp-Asp-可以与其结合，正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割纯化的重要工具. 大肠杆菌（Escherichia coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米.周生鞭毛，能运动，无芽孢，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体和简单的细胞器，有拟核；异养兼性厌氧型.它的遗传物质主要是拟核中的一个环状DNA分子，同时可以有多个环状质粒DNA.由于其技术操作简单，培养条件容易，大规模发酵经济，备受研究生产的应用.目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系.因而，大肠杆菌也就成为生产胰岛素的“活工厂”.
工程菌是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点.高密度发酵具有鲜明的特征，这种特征是由于菌种在接种前后生长、繁殖、代谢的环境改变剧烈而造成的.小实验中，培养瓶的摇床培养一般能满足好氧菌所需要的氧气需求，而大型发酵罐中，在一个大气压下，30度时氧气在水中的溶解度仅为1.16 mmol/L，而一般大肠杆菌的发酵要求达到200 mmol/L.h左右，在发酵过程中要严格控制杂菌污染，因此必须以一定的速率向发酵罐中通入无菌空气.如何控制转速，空气通量和排气量，文持一定的压力使培养基中的营养物质，空气和大肠杆菌充分接触；如何通过营养物质的添加，酸碱的流速防止代谢过程中酸的过量积累而阻碍菌体的生长繁殖；温度的控制对菌体生长和质粒稳定性的双重影响等等因素，小规模发酵比较容易控制，且影响不大，但大规模生产则要通过各种各样的设备来监控调节.同时微生物生长繁殖的最适培养基与其代谢物合成所需的培养基一般是有差别的，因此补料营养物质的改变也是必须的，不能简单的将实验室中小实验的大肠杆菌的培养运用到生产上.
为了达到发酵过程的控制，首先要对反应器内各项控制指标进行测量，测量仪器的核心是传感器及放大变换装置，要求准确无误.测量的数据的收集、分析、处理和控制的具体操作，可以人工判断、操作、也可由计算机系统、仪器、仪表和自动化设备完成.
本实验目的在于明了大规模发酵的流程，理清发酵过程中各种参数与菌体生长之间的关系，很好地控制它，使发酵过程优化，保障重组大肠杆菌发酵按预定的最佳动力学过程进行，进而使菌体大量繁殖，产出大量的目的产物--肠激酶.许多现代生物技术获得的成果未能产业化，稳定的控制和顺利的后处理往往成了不能通过的瓶颈问题.
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