REK重组大肠杆菌的发酵优化(3)
1. REK大肠杆菌的鉴定
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器
吸附柱 高速离心机 移液枪 恒温振荡器 EP管 电泳仪、紫外检测仪、微量加样器、微波炉
1.1.2 试剂
SolutionI（加入RNaseA），II,III
Elution Buffer：65 °C预热
NdeI#R0111s酶
BamHI#R0136s酶
6×Loading Buffer
花青素
Marker
50×TAE缓冲液（50 ml）：称量Tris 12.1 g，Na2EDTA•2H2O 0.9306 g于烧杯中；向烧杯中加入约40 ml纯化水，充分溶解；加入2.855 ml的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加纯化水定容至50 ml后，高压灭菌，室温保存.（已配制）
1×TAE缓冲液：取50×TAE 8 ml 加去离子水定容至400 ml.
1.1.3 琼脂糖凝胶配制
（1）将电泳仪水平放在桌面上，调整仪器四角的螺钉，使仪器中央的气泡位于圆圈中央.将黑色密封橡胶条插入制胶板两侧，制胶板放入电泳槽中.根据样品浓度与上样量选择梳齿，窄梳齿在配胶时可上样7 µl，宽梳齿在配胶25 ml时可上样10 µl.在黑色电极一侧放置样品梳，调整梳齿位置，距离制胶槽底部约1mm.（梳齿切忌不可接触到胶槽底部）
（2）根据REK重组质粒及其酶切产物的长度，适用1.0%-1.25%的琼脂糖凝胶.配制25mL 1.0%的琼脂糖凝胶：称取0.25 g琼脂糖，置于干净的100 ml烧杯中，加入25 ml 纯化水，500 ul 50×TAE缓冲液，充分搅匀，盖上平皿，用微波炉加热，使之彻底融化.（一般以100火力加热1 min；注意：加热期间听到沸腾的声音要立即打开微波炉门，防止溶液溢出）稍微冷却，加入15 µl花青素混匀，倒入制胶槽，静置约20min，待琼脂糖彻底凝固后，轻轻拔出样品梳.即制成1.0％的琼脂糖凝胶.（倒胶时不可产生气泡）
1.2 REK重组质粒提取流程
（1）DNA吸附柱平衡处理：
向吸附柱中加入200ul buffer CBS，12000rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中备用.
（2）视菌液生长情况，一般取4 ml LB培养基过夜培养的菌液，8000 rpm离心1 min，弃去上清
（3）加入300 ul SolutionI ，用枪头吹打，充分悬浮菌液.
（4） 加入500 ul SolutionII ，立即温和并充分上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解并形成透亮的蛋清状溶液.（此步骤时长不宜超过5 min）
（5）加入700 ul SolutionIII ，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温静置5 min.然后12000 rpm，离心10 min .
（6）将步骤5中的上清液转移至套放于2ml收集管内的DNA 吸附柱中，室温6000 rpm 离心1 min，取出DNA 吸附柱，倒掉收集管中废液.
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