外源NO-ABA对弱光胁迫下紫花苜蓿叶片超显微结构及光合关键酶活性的调控作用(3)
2017年3月上旬，将花盆移入不同遮光强度的大棚。大棚规格为3 m×4.5 m，设两种遮荫梯度，采用TES-1339照度计测定其光强，一层遮阳网为全光照的（46.3±1.8）%，记为L1，二层遮阳网为全光照的（28.5±0.7）%，记为L2，未遮阴大棚光强为对照，记为L0。叶面喷施6种不同处理，分别为0.1mmol•L-1SNP，2.5mmol•L-1钨酸钠，0.1mmol•L-1cPDIO，5mg•L-1ABA，2.5mmol•L-1钨酸钠+0.1mmol•L-1cPDIO， 0.1mmol•L-1SNP+5 mg•L-1ABA，L0及各遮阴棚中植株的叶片喷施相同体积的蒸馏水作为对照（CK）。每种处理设置4个重复，每隔1天喷施一次，总共喷施3次，每次500 ml。
1.3 参数测定
1.3.1 植物根茎叶和叶面积的测定
2017年4月下旬，不同的外源物质处理30天后，每种处理中在每个花盆中随机选取3个植株。各植株根、茎、叶分开。叶片用JC503-AM-300叶面积仪进行测定叶面积后，与根、茎分别在105℃下杀青45 min，65℃烘干至恒重，称重。
1.3.2 叶片光合特性的测定
2017年4月下旬，不同的外源物质处理15天后，每个花盆选择东、西、南、北四个方向的中上部成熟叶片各1片，连续三天，用LI-6400便携式光合仪（美国LI-COR公司）测定其光合特性。设置叶温25℃，流量500μmol•s-1，使用红蓝光源，光强1000μmol（m•s）-1，采用CO2提供氧气。待读数稳定后，记录所示数据，每片待测叶重复三次，取其平均值。测定的光合参数包括：净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）以及蒸腾速率（Tr）。羧化效率（CE）由Pn/Ci估算。
1.3.3 叶片超显微结构的测定
2017年3月下旬，不同的外源物质处理15天后，随机切取主茎顶部第3-4片完全展开叶叶片中部主脉两侧1-2 mm见方小块，先用2%戊二醇前固定4小时，再用0.1mmol•L-1磷酸缓冲液（pH7.2）冲洗3次，2%锇酸后固定，乙醇-丙醇梯度脱水后，使用Epon-812环氧树脂进行包埋，LKB-5超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，采用JEM-1200EX型透射电镜（JEOL，Tokyo，Japan）观察切片。
1.3.4 Rubisco酶活性的测定
2017年3月下旬，不同的外源物质处理15天后，随机取主茎顶部第3-4片完全展开叶的叶片0.05g.置研钵中加液氮固定并迅速磨成粉状，加入1ml Rubisco预冷抽提液（含50mmol•L-1Tris-HCl pH7.5)1mmol•L-1，10mmol•L-1MgCl2、12.5%(V/V)甘油，1%(W/V)可溶性PVP，使用前加0.1%β-巯基乙醇）。使用匀浆器，磨成均浆30s，停30s，交替三次。汲取此均浆1ml在15000g高速离心15min，整个过程应在0~4℃下进行，上清液即为酶粗提液。0℃保存，备用。
初始活力的测定：取100μl•ml-1酶粗提液迅速加入到900μl ml-1达到测定温度的测定液(含Hepes50mmol•L-1(pH值8.0)EDTA 1mmol•L-1， MgCl2 20mmol•L-1，DTT(二硫苏糖醇)2.5mmol•L-1， NaHC03 1mmol•L-1， ATP 5mmol•L-1，磷酸肌酸5mmol•L-1，NADH 20.15mmol•L-1、磷酸肌酸激酶10 U• ml-1、甘油醛-3一磷酸脱氢酶10 U• ml-1，磷酸甘油酸激酶10 U •ml-1， RuBP0.6mmol•L-1)，摇匀，倒入比色杯，以蒸馏水作为空白，作为零点值并开始读数，每隔5s记录340nmOD值至30s为止。此过程在28℃下进行。
总活性的测定：取100μl酶粗提液，加人到装有200μl•ml-1酶活化反应液的比色杯中(最终浓度中各成分的含量为:33mmol•L-1Tris-HCI (pH7.5)，0.67mmol•L-1EDTA，33mmol•L-1MgCl2，10mmol•L-1NaHC03)温度为28℃，活化10 min后迅速加入28℃温育的700μl。总活力分析测定液，最终浓度中各成分与Rubisco初始活力测定相同，并按初始活力的相同的方法读数。Rubisco的活化状态由初始活力与总活力的比值求得，叶片酶粗提液中Rubisco活力的测定必须在粗提液抽提后30 min内完成。