西维因降解菌株A-1的分离及其西维因降解途径的研究(2)
2.2 代谢途径的推断 15
全文总结 16
致谢 17
参考文献 18
西文因降解菌株A-1的分离及其西文因降解途径的研究
引言：
西文因是一种氨基甲酸酯类农药，它具有选择性强、杀虫谱广、用量少、药效快等优点，目前已被广泛用于替代有机氯农药，成为了第三大类杀虫剂。氨基甲酸酯类农药可分为五大类[1]：①萘基氨基甲酸酯类，如西文因（甲萘威）；②苯基氨基甲酸酯类，如异丙威、速灭威、残杀威；③氨基甲酸肟酯类，如灭多威、涕灭威（铁灭克）；④杂环甲基氨基甲酸酯类，如呋喃丹（克百威）；⑤杂环二甲基氨基甲酸酯类。由于大面积和长期地使用该类农药，在环境中残留的西文因会对人类的健康和生态环境的平衡产生潜在的威胁，这主要是由于西文因会对动物神经系统、免疫系统、内分泌系统和生殖系统造成严重的损害。
西文因的降解方式主要有微生物降解和高温碱解两种，而以生物降解方式处理环境中残留的西文因污染不仅是一种环境友好型的处理方式，还具有彻底、高效、不会产生二次污染等优势，选择恰当的微生物作为材料，可以将西文因降解为H2O、CO2等低毒或无毒的物质，从而降低环境中污染物的浓度，以减轻其危害[2,3]。
本论文主要从以下几个方面进行研究：
1、分离鉴定西文因降解菌。
2、研究菌株的生物学特性及降解特性。
3、研究菌株西文因降解途径。
第一章 西文因降解菌的分离和生物学特性及降解特性研究
西文因（Carbaryl，1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯）是一种广谱的氨基甲酸酯类农药，广泛地应用于谷物、蔬菜、水果等农作物的病虫害防治中，具有触杀及胃毒作用。西文因在环境中残留时间较长，长时间暴露在西文因环境下会对神经系统、免疫系统、内分泌系统造成损害。目前已在地表水中广泛检测出西文因残留[4,5,6,7]，微生物降解是去除西文因残留的主要自然途径和最为有效无害的途径。
本研究从西文因长期污染的土壤中分离到一株西文因降解菌，研究其生物学特性和降解特性，为其他研究提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 培养基与菌株
基础盐培养基(MM)：KH2PO4 (0.5 g•L-1)，K2HPO4 (1.5 g•L-1)， NH4NO3 (1.0 g•L-1)，NaCl (0.5 g•L-1)，MgSO4•7H2O (0.2 g•L-1) pH 7.0
富集分离培养基：在基础盐培养基中添加34 mg•L-1西文因作为唯一碳源。
LB培养基：酵母膏 (5.0 g•L-1)，蛋白胨 (10.0 g•L-1)， NaCl (10 g•L-1)，pH 7.0（固体加2.0%的琼脂条）
1/10LB培养基：酵母膏 (0.5 g•L-1)，蛋白胨 (1.0 g•L-1)， NaCl (1.0 g•L-1)， pH 7.0（固体加2.0%的琼脂条）
E.coli DH5α为本实验室保存；pMD18-T-simple 购自大连宝生物公司(TaKaRa Biotechnology Co. Ltd.)。
1.2 化学试剂
西文因（carbaryl，98%），采购自江苏徐州神农化工有限公司。1-萘酚（1-naphthol）化学试剂（AR）采购自上海化学试剂厂。二氯甲烷为分析纯。甲醇为液相色谱纯。DNA凝胶回收试剂盒采购自Axygen公司。PCR引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
1.3 西文因降解菌的分离
取受西文因污染的土壤10 g，置于含100 mL的基础盐培养基的锥形瓶中，添加西文因使终浓度为50 mg•L-1，于30℃，180 rpm培养5天，然后以5%的接种量转接到相同的培养基中，传代数次。用紫外扫描仪检测富集液中西文因的降解率，直至紫外扫描检测富集液中西文因的降解率大于80%以上。将具有降解效果的富集液稀释以10-4-10-8稀释度各0.1 mL涂布于含有100 mg•L-1西文因的1/10LB固体平板上30℃培养3天。挑取不同形态的单菌落于LB中培养纯化，通过HPLC验证其降解功能，从而获得西文因降解菌。