手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性(2)
有机磷被广泛用作杀虫、杀菌、除草及植物生长调节剂，这些手性化合物的手性既可源于不对称碳原子，也可源于磷原子，因此手性品种非常多（大约60余种）。它们绝大多数为四价五配位的磷化合物，通常具有P=S或P=O以及其他三个与磷原子相连的取代基，构成一个四面体构型。当A，B，C为三个各不相同的取代基时，磷原子就成为一个手性中心，形成了一对对映异构体。有机磷手性农药对映体之间存在着不同的生物活性，包括毒性、酶抑制活性和生物降解能力等[7]。迄今，人们已对有机磷对映异构体的制备、分离、各种生物活性进行了大量的研究[8]。研究表明有机磷不同对映体间的相对药效、毒性、酶抑制活性和生物降解等方面的差异有时很大（如苯腈磷、异柳磷），有时较小（蔬果磷）[9]。
甲基异柳磷，O-甲基-O-(二异丙氧基羰基苯基)-N-异丙基硫代磷酸酯（图1），含一个手性磷原子，两个对映体，具有较强的触杀性和胃毒性，杀虫谱广，残效期长，主要用于防治地下害虫，对蚜虫、红蜘蛛、梨小食心虫等具有较好的活性。目前，关于该药物的手性拆分方面的研究还鲜有报道，在相关农产品及土壤中的降解，乃至甲基异柳磷在对映体水平上对靶标生物的活性，对非靶标生物的急性毒性及对靶标酶的抑制活性方面尚未见报道。前期研究表明，细胞受损伤的程度与胞外的乳酸脱氢酶（LDH）的释放量有较好的正相关性[10]。氧化应激可以简单的认为是氧自由基的过量生成导致的细胞磷脂层发生的过氧化反应和机体防御体系的能力失衡[11]。如果机体长期处于氧自由基过量或抗氧化能力不足这一状态，很可能会对机体产生慢性的、不可逆的伤害。药物在不同组织中暴露导致的氧化应激现象已被认为是导致生态毒性和细胞毒性产生的主要原因[12,13]。
图1 甲基异柳磷两个对映体的结构图（*为手性中心）
本课题以此为切入点，首先建立起能够有效拆分甲基异柳磷两对映体的仪器拆分条件，在此基础上，选用Hep G2细胞为体外实验模型，研究了甲基异柳磷外消旋体及其对映体对Hep G2的细胞毒性。 此外，本论文进一步研究了甲基异柳磷两对映体作用后导致Hep G2 产生氧化应激反应（相关指标：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA））的对映体选择性差异，探讨甲基异柳磷对Hep G2细胞产生对映体选择性细胞毒性和氧化应激之间的关系。本课题研究手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性，对手性农药的使用和安全性评价具有重要意义。
1实验材料
1．1细胞系
选用肝癌Hep G2细胞系为体外实验模型。
1.2实验药剂
Rac-甲基异柳磷分析标准品（98.1%），甲基异柳磷对映体（99.9%，上海勤路生物技术有限公司）。
1.3主要仪器和试剂
高效液相色谱Aglient1200（Agilent, USA）；Lux Cellulose-3(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm) (Phenomenex,China)；超纯水系统MUL9000（南京总馨纯水设备有限公司，中国）；Jasco J815圆二色谱仪（东京，日本）；酶标仪；各种规格的单通道移液枪（eppendorf，德国）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；细胞培养板（24孔、96孔，COSTAR, USA）；二氧化碳培养箱（赛默飞世尔，美国）；Avanti J-26S XP 高速离心机(Beckman Coulter, USA)；恒温水浴箱；4℃、-20℃和-80℃冰箱（海尔，中国）；液氮储存罐(ARPEGE40-LIQUIDE,上海沪峰化工有限公司)；细菌过滤器（费森尤斯，德国）；细胞培养瓶（COSTAR, USA）；酒精灯。