手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性(4)
2.3.3细胞传代
直接吸出培养液细胞，以100转/min，离心5min，弃去上清，重新加入新鲜培养液，轻轻吹匀分置于其他培养瓶中，使细胞密度在1×105-2×105个/mL，加培养液继续培养。
2.3.4细胞处理
Hep G2细胞生长至对数期即可用于后续实验。为测定细胞毒性和氧化应激损伤，细胞以1×105-4×105个/mL的初始密度接种于96孔板中24h。然后加入外消旋体及其对映异构体染毒24h。不同浓度的测试化合物临用前用无水乙醇稀释，再加入实验培养液配制所需浓度，且保持容积乙醇的体积浓度≤0.1%。以0.1%体积浓度的无水乙醇作为实验的对照组[15]。
2.4细胞活性测定（CCK-8法）
CCK-8法是一种操作简单，灵敏度高，准确性和重复性较好的，检测细胞增殖活性的方法。实验方案如下：
1.在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养24h（37℃，5%）；
2.向培养板中加入100μL完全培养基或含有不同浓度受试样品的完全培养基；
3.将培养板在培养箱中孵育一段避光时间24h；
4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它会影响OD值的测定）；
5.将培养板在培养箱内孵育1-4h；
6.用酶标仪测定在OD450nm波长处的吸光度；
细胞存活率=[（实验组As-空白组Ab）/（对照组Ac-空白组Ab）]×100%
细胞抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%
As：试验孔（含有细胞的培养基，毒性物质 + CCK-8）
Ac：对照组（含有细胞的培养基，没有毒性物质 + CCK-8）
Ab：空白孔（不含细胞和毒性物质的培养基 + CCK-8）
如果暂时不测定打算以后测定的话，可以后每孔中加入10μL0.1M HCl或1%w/vSDS，避光可保存24h。
2.5乳酸脱氢酶（LDH）的释放量的测定
收集对数生长期的Hep G2细胞，以l×105 个/mL的密度接种于培养皿中（5mL）。置培养箱中孵育24h后，换成用10%胎牛血清培养液配制的浓度为100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L的甲基异柳磷外消旋体及其对映体的试剂培养液，对照组加入等量培养液置于培养箱内培养24 h。收取各浓度染毒24 h后的细胞上清液作为待测样品，把样品上清液按照操作表1加样。再用酶标仪测定各孔在440 nm波长处的0D值，每个浓度设置5个平行，重复3次。最后根据以下公式，计算LDH释放量(U/gprot)。