利用CRISPRCas9技术构建棉铃虫UGT41B3和UGT40D1基因敲除品系(2)
糖基转移酶是自然界存在最为多样性的一大类酶，广泛存在于原核生物、真核生物、细菌及病毒中，它主要负责将活性供体的糖单体部分转移到特异的受体上，形成特异的糖苷键以参与糖基化反应。而糖基化作用又参与抑制和排除生物体多种内源性和外源性有毒化合物的过程，UDP-糖基转移酶（UGT）在这一过程中起到非常重要的作用[4]。
Krempl[5]等用棉酚喂养棉铃虫后，用Rojas[6]等人描述的苯胺方法检测幼虫体内游离棉酚以及粪便中棉酚代谢物的总量，同时通过生物测定和基因芯片分析，选出可能与UGT相关的七个候选基因UGT40D1、UGT40D2、UGT40Q1、UGT41B1、UGT41B3、UGT42B2和UGT33B4。当这些被选择出的基因在昆虫细胞sf9中表达后，提取进行蛋白质印记杂交，并根据通过x射线扫描出的带的亮度来计算出酶活测试中需要的异源UGT蛋白的量，最后发现UGT41B3和UGT40D1基因产物能够使棉酚糖基化，证明了棉铃虫可以利用UGT通过糖基化对棉酚进行代谢。
CRISPR/Cas9 系统是最近被发现并发展的一种强有力的基因编辑工具，就是根据要编辑的靶标DNA序列，在体外合成指导RNA(guide RNA，gRNA)，gRNA结合Cas9并将Cas9靶向到靶标DNA并剪切靶标DNA，在生物体内修复DNA缺口的过程中产生基因突变，破坏基因开放阅读读框，从而实现基因编辑。CRISPR/Cas9系统作为一种新兴的功能强大的基因编辑技术，操作简单、省时省力、高效快捷，已经革新了生物基因功能研究的方法，目前在相当多的昆虫中得到了应用。我们通过CRISPR/Cas9技术敲除了棉铃虫的UGT41B3和UGT40D1基因，筛选并获得基因敲除纯合突变体，构建UGT41B3和UGT40D1基因敲除品系，为更好揭示这两个基因在棉铃虫对棉酚和杀虫剂解毒代谢中的作用提供了有效的材料。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试昆虫
敏感品系（SCD）：是20世纪70年代源自科特迪瓦（Cote D’Ivoire）的敏感品系，2001年由拜耳公司提供。在室内不接触任何杀虫剂的条件下用人工饲料连续饲养[7]。
以上棉铃虫品系幼虫饲养于麦胚粉和大豆粉组成的人工饲料上，置于26±1℃恒温，光周期（16L：8D）的光照养虫室。成虫置于相同温度和光照、60-70%湿度的养虫室中，用10%糖水补充营养。
1．1．2 主要仪器和试剂
PCR扩增仪Mastercycler® epgradient S型PCR仪，eppendorf公司；
恒温振荡器ZHWY-200B，上海智成分析制造有限公司；
离心机Centrifuge 5417R，德国eppendorf公司；
水平式核酸电泳仪，北京市优尔一仪器厂；
凝胶成像系统Gel Doc2000，BioRad公司；
Axyprep基因组DNA小量试剂盒；
PCR引物由Genewiz合成；
PCR反应试剂采购自Novopretein；
检测PCR产物琼脂糖材料采购自Biowest等；
Cas9 蛋白(GeneArt™ CRISPR Nuclease protein) 采购自Thermo Fisher Scientific (上海，中国)；
sgRNA合成利用Precision gRNA Synthesis Kit，采购自Thermo Fisher Scientific (上海，中国)。
1．2 实验方法
1．2．1 sgRNA设计
根据UGT41B3和UGT40D1基因的结构特点，并利用CRISPRdirect（http://crispr.
dbcls.jp/）网站预测寻找sgRNA靶标位点。
UGT41B3基因的靶标位点为GCCAGTCATGGGAGACCAGCCGG，UGT40D1基因的靶标位点为GTTCATTTGGATATCATCGGTGG，下划线为PAM序列。合成sgRNA模板DNA的引物设计原则为前向引物F: TAATACGACTCACTATAG+靶标序列16-20nt，反向引物R：TTCTAGCTCTAAAAC+靶标序列的互补序列的19-20nt（图1A和图1C）。具体序列为：
UGT41B3F:TAATACGACTCACTATAGCCAGTCATGGGAGACCAGC；
UGT41B3R:TTCTAGCTCTAAAACGCTGGTCTCCCATGACTGGC；
UGT40D1F: TAATACGACTCACTATAGTTCATTTGGATATCATCGG；
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