利用CRISPRCas9技术构建棉铃虫UGT41B3和UGT40D1基因敲除品系(3)
UGT40D1R:TTCTAGCTCTAAAACCCGATGATATCCAAATGAAC。
sgRNA的合成依照Precision gRNA Synthesis Kit说明书完成，具体过程如下。
(1)合成sgRNA的DNA模板
配制25μL PCR反应体系：
Pfusion™ High-Fidelity PCR Master Mix 12.5μL
Tracr Fragment + T7 Primer Mix 1μL
0.3μM Target F1/R1 oligonucleotide mix 1μL
Nuclease-free water 10.5μL
PCR程序98℃10秒,32个循环(98℃ 5秒, 55℃ 15秒),72℃1分钟，4℃保存。
(2)体外转录sgRNA
配制20μL反应体系
NTP mix (100 mM each of ATP, GTP, CTP, UTP) 8 μL
gRNA DNA template 6 μL
5X TranscriptAid. Reaction Buffer 4 μL
TranscriptAid. Enzyme Mix 2 μL
37℃孵育2-3小时；
在反应体系经过转录反应后加入1μL 的DNaseI并在37℃孵育15分钟。
(3)纯化转录出的sgRNA
①将IVT反应体系的体积用无核酸酶的水加到200μL；
②加入100μL的结合缓冲液。通过移液管混合完全；
③加入乙醇(>96%)并通过移液管混合完全；
④将混合液转移至 GeneJET™ RNA Purification Micro Column，并且在14000g转速下离心30-60秒。舍弃废液；
⑤加入700 μL的清洗缓冲液1（用13mL大于96%的乙醇稀释）并且在14000g转速下离心30-60秒。舍弃废液；
⑥加入700 μL的清洗缓冲液2（用30mL大于96%的乙醇稀释）并且在14000g转速下离心30-60秒。舍弃废液并重复；
⑦在14000g转速下将净化柱再次离心60秒以完全去除残留的清洗缓冲液，并且将净化柱转移到一个干净的1.5mL收集管中；
⑧在净化过滤柱的中央加入10μL的无核酸酶水，并且在14000g转速下离心60秒来洗提gRNA。
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