甜菜夜蛾P450基因上游调控序列分析(2)
细胞色素P450在整个酶系的末端起氧化作用，典型反应是将一分子氧还原的同时，将一个氧原子转移至底物[3]。 P450酶底物具有多样性，意着其能催化多种生化反应，除氧化反应外，还可参与羟基化、脱硫化、脱烷基化、脱氢和水解等60多种类型的反应[4]。
细胞色素P450是个庞大的家族，其多样性的根本原因是其基因结构的多样性。除个别情况外，一种P450基因只能产生一种P450蛋白[5]。自1965年研究首次发现昆虫体内的P450以来[6]，昆虫P450研究的速度正快速发展，各种细胞色素P450基因不断被发现。但研究主要集中在农林害虫和卫生害虫少数几个目的昆虫上面，对其他目昆虫P450的研究还需进一步加强［7］。
细胞色素P450酶系由多种细胞色素和还原酶以及其他成分组成，其中最重要的是细胞色素P450和细胞色素P450还原酶。细胞色素P450是酶系的末端氧化酶，底物和产物的特异性主要由其决定，更是酶系的重要结构部分[8]。在P450超基因家族在具有高度的变异性的同时，主要功能区也保有较高的同源性[9]。
到目前为止，研究发现的昆虫P450的功能有两种：催化昆虫体内源性物质的生物合成和降解，调节昆虫的生长、发育和生殖过程[10,11]；代谢外源性物质，使得昆虫对化学药剂产生抗药性，并且使昆虫增强对宿主植物的适应[12]。
昆虫P450细胞色素能够被多种外源性物质所诱导。在昆虫P450的调控方面前人已经作出过详细的论述。目前已经发现多种造成P450基因过量表达的调控机制，这些调控机制均已得到验证 [13]。P450介导昆虫抗性的可能机制包括P450的过量表达和P450氨基酸残基的改变。而调控基因的突变导致的P450的过量表达可能是P450介导抗性的主要机制[14]。
昆虫细胞色素P450基因功能的表达与调控是P450研究的重要内容之一。其表达调控是生物体内外许多种因素相互作用的结果。在基因水平上的最主要的调控环节为基因激活和转录调节。而顺式作用元件和反式作用因子则是基因转录的调控两个关键因素[15]。调控通过改变转录因子直接影响转录，也可改变转录抑制因子间接的影响转录，或者在转录后改变mRNA的稳定性使转录异常 [16]。
目前为止，昆虫P450的表达调控机制在有关昆虫抗药性方面一直是研究的热点，在分子水平上还没有充分直接的的有力证据。只有对基因表达调控的分子机制有了细致入微的了解，才能真正揭示昆虫抗药性的分子基础,对于抗性昆虫的治理和防止昆虫产生抗药性才能真正起到帮助。
1 材料与方法
1.1供试昆虫
甜菜夜蛾敏感品系由武汉科诺生物技术有限公司提供，在未接触任何药剂的条件下在室内饲养至今，室内高效氯氟氰菊酯抗性品系于2016年10月采自广东省惠州市，经过室内多代筛选，已产生高抗性。在温度 27℃±2℃，湿度 70%～80%和光周期 16h（L）:8h（D）的光照培养箱中饲养。
1.2方法
1.2.1 RNA提取
选择3头甜菜夜蛾幼虫放入2ml玻璃匀浆器，加入1ml TRIzol (Life technologies)试剂并充分研磨。将研磨液转移至1.5ml离心管中，4℃下12000g离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s，静置10 min, 4℃下12000 g离心10 min。取上清液转入新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇沉淀RNA，充分混匀后，室温下静置10min，4℃下12000 g离心10 min。弃上清液，加入1ml 75%乙醇（RNase-free水配制）洗涤样品，在4℃下7500 × g离心5 min。弃上清液后，室温放置晾干或者置于超净台里吹干（5-10 min），加入适量的Rnase-free水，用枪头吹打使RNA充分溶解。电泳检测提取RNA的完整性，并用分光光度计测定RNA的浓度、纯度和OD260/280值，置于-80℃超低温冰箱保存备用。