甜菜夜蛾P450基因上游调控序列分析(3)
1.2.2 RT-PCR
定量PCR模板采用Vazyme公司的HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)：首先去除基因组DNA,将TotalRNA定到500 ng，然后加入SuperMix在25℃ 10min；50℃ 30min；85℃5min条件下进行逆转录反应。
1.2.3 定量PCR检测mRNA表达量
根据研究中获得的甜菜夜蛾CYP450基因的RNA全长，利用Primer Premier v.5.0软件设计多对引物，并对这些引物进行定量筛选，并选择出一对扩增效率高、特异性好的定量引物，同时选用GAPDH基因为内参（见表1）。本试验采用的荧光染料SYBR GreenⅠ可与所有的双链DNA结合，通过检测反应中SYBR GreenⅠ的荧光强度来反映出PCR产物扩增量。Q-PCR反应采用ABI 7300型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems,Foster City,CA）。反应试剂选用康为世纪公司Ultra SYBR Mixture （with ROX），依据说明书在96孔PCR板中依次加入Template cDNA 2 μl、上下游引物各1 μl、2 × UltraSYBR Mixture（With ROX）12.5 μl、RNase-free Water 8.5 μl，共25μl。定量PCR反应程序为：95℃ 10min；95℃ 30 s, 60℃ 40s,添加溶解曲线，共40轮。利用Sequence Detection Software Version 1.4(Applied Biosystems)软件进行Ct值的计算、导出与溶解曲线分析。每个模板3次生物学重复，每个cDNA模板三次机械重复