盐胁迫对两种油菜品种及其杂交后代的内源性硫化氢代谢和氧化损伤影响的初步(3)
2.3.3硫化氢测定。
硫化氢测定采用亚甲基蓝法，并且需要使用用硫化钠溶液绘制标准曲线[13-14]。
N-N-二甲基对苯二胺的盐酸盐能够在含有高铁离子(Fe3+)的条件下与样品中硫离子反应生成亚甲基蓝，该物质在670 nm处有最大吸收峰。通常情况下需要添加锌离子(Zn2+)防止硫化氢在酸性条件下逸出。植物样品中硫化氢含量较低，因此排除了因硫化氢浓度过高和pH值过低导致逸出的情况，故不需要加入醋酸锌溶液以沉淀硫化物。
取0.2 g植物样品，用2 mL的20 mM的Tris-HCl溶液(pH=8.0)进行研磨，离心后取1 mL提取液用同浓度的Tris-HCl溶液稀释一倍，加入100 μL的30 mM 氯化高铁溶液（溶于1.2 M HCl）和100 μL的 20 mM N-N-二甲基对苯二胺溶液溶液（溶于7.2 M HCl）。以去离子水为空白对照测定670 nm处的吸光度。
使用0.2 M Na2S 的20 mM的Tris-HCl溶液进行标准曲线的绘制，将硫化钠的Tris-HCl溶液每次稀释一倍，共稀释18次，取2 mL的稀释液加入100 μL的30 mM 氯化高铁溶液（溶于1.2 M HCl）和100 μL的 20 mM N-N-二甲基对苯二胺溶液溶液（溶于7.2 M HCl）。以去离子水为空白对照测定670 nm处的吸光度。绘制并计算稀释8次至稀释18次的吸光度的标准曲线。
2.3.4 L-半胱氨酸脱巯基酶活性测定
由于目前测定植物样品中的L-半胱氨酸脱巯基酶的先例较少，故采用基于亚甲基蓝法的方式[15]测量L-半胱氨酸脱巯基酶催化反应L-半胱氨酸产生的产物[16-17]，并且需要使用醋酸锌溶液沉淀提取液中已有的硫化物。需要绘制标准曲线。
使用2 mL的20 mM的Tris-HCl溶液 (pH=8.0)在冰浴条件下研磨0.2g的冷冻植物样品，加入100 μL醋酸锌溶液，在冷冻离心机中以12000 rpm离心15分钟。取提取液稀释10倍后以100 μL的稀释液用反应液（含有0.3 mM的L-半胱氨酸和2.5 mM的二硫苏糖醇的100 mM Tris-HCl溶液，pH=9.0）在37℃下反应15分钟进行酶活测定。反应时间结束后加入100 μL的30 mM 氯化高铁溶液（溶于1.2 M HCl）和100 μL的 20 mM N-N-二甲基对苯二胺溶液溶液（溶于7.2 M HCl），以去离子水为对照测定670 nm处的吸光度，计算酶活。
2.4统计分析
选择至少6次实验结果的数据的平均值，使用t检验对数据进行显著性统计分析。
3.结果和分析
3.1 盐胁迫诱导内源性硫化氢含量提升
根据硫化钠标准溶液进行标准曲线绘制表1，经计算得标准曲线为 y = 0.0058x + 0.0719，相关系数符合要求(R2>0.99), 可测定浓度范围为1.5-400 μM。根据以往实验结果[14]该方法最低检出限为0.07 μM。