一步法测定血浆中游离核酸成分的研究(2)
取样以检测细胞遗传物质的改变[1]
，但该诊断方法取材不便，且对患者有较大伤害。因此，
临床强烈需求发展一种在癌变早期即可有效诊断，同时具有高敏感性和微创性的检查方法。
1.1 检测血浆中游离核酸的意义
游离 DNA 又被称作循环 DNA，是一种以单链或双链形式存在，无细胞状态、存在于血
浆或血清、滑膜液等体液中的细胞外DNA； 根据来源不同，又可分为核 DNA 和线粒体DNA。
1947 年，Mandel 和 Metals 首先发现了人类外周血中含有游离核酸。30 年后，Leon 等[2]首先报道肿瘤患者外周血中游离 DNA 水平高于正常人。后续学者陆续研究表明，体液中游离核
酸处于一种动态平衡过程，会因细胞受外源刺激主动分泌，或者细胞损伤或死亡后坏死组织
释放入血浆中产生，其变化与临床多种疾病尤其是肿瘤密切相关 [3,4,5]。
正常人血液中游离 DNA 含量极少，而在肿瘤患者以及机体处于妊娠等特殊状态时，游
离 DNA 含量会有特征性的明显上升。Leon 等[2]用放免法检测了各种癌症患者和健康人血浆
中DNA水平，正常人血浆DNA 浓度平均为13±3ng／ml，而癌症患者平均为 180±38ng／ml，
远远高于正常人；伴有转移的患者血清 DNA 含量平均为 209±39ng／ml，高于局灶病变者的
水平(100±30ng／m1)；接受放疗的过程中，DNA 水平有所下降；如治疗后 DNA 浓度仍保持
在较高水平，往往提示治疗无效。
血清是未经抗凝处理的全血自发凝固后，通过离心血凝块聚缩释出的不含细胞成分的上
清液；血浆是经肝素等抗凝剂抗凝处理后的全血通过离心沉淀所获得的不含细胞成分的上清
液[6]。相比而言，血浆样本的取得较为方便快速。患者血浆中的游离核酸在肿瘤发生的早期
即已存在较高水平，在治疗后也有残存，是一种合适的生物标志物，通过检测血浆中游离核
酸水平以诊断肿瘤疾病的手段因此具有简便快速，无创伤性等优点，并在肿瘤临床早期诊断
以及判断预后方面都具有重大意义。 1.2 实时荧光定量 PCR 技术
实时荧光定量 PCR技术（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）是
目前分析基因转录水平表达差异的重要方法，自 1996年由美国 Applied Biosystems 公司推出
以来，它已被广泛应用于生物学、基础医学、法医学、诊断学等多个领域。作为一种多色荧
光检测核酸定量技术[7]，实时荧光定量PCR 技术的基本原理为：在 PCR反应体系中加入荧光
基团，通过荧光信号积累来实时监测整个 PCR进程。反应体系连续不断地检测荧光信号的变
化量，其增加到某一阈值时所对应的 PCR循环次数即循环阈值(Cycle threshold，Ct 值)将被记
录下来，为检测初始数据。Ct 值与PCR体系中的起始模板拷贝数的对数存在线性关系，通过
对数据的分析处理，即可推断出样品的初始模板拷贝数[8]。
实时荧光定量 PCR技术对应的主要分析方法包括：绝对定量的标准曲线法，相对定量的
标准曲线法，相对定量的比较 CT 法。绝对定量法需要制备标准品，而各个实验室之间目前
对此尚无统一标准，导致实验结果缺乏可比性；相对定量法不需要制备标准品，而是以内参
照基因作为标准，通过数学公式计算出相对表达量，不受初始样本限制，应用较为广泛。其
中，相对定量的标准曲线法原理为：通过选取具代表性的某样本模板作梯度稀释与扩增得到
CT值绘制标准曲线，对未知模板进行定量分析。目前分析应用最普遍计算法的则是相对定量