一步法测定血浆中游离核酸成分的研究(3)
的Livak 法，也称作 2－△△CT 法，这也是最简便的一种分析方法，适用于目的基因和内参照基
因扩增效率都接近 1的理想情况。具体原理可表述为：在理想的 PCR反应中，每次循环增加
一倍的扩增产物，其扩增效率（Ex）为 1，第 n 次循环后的产物量即为 X＝X0（2）n，其中X0为初始样本的 mRNA水平，n为扩增反应的循环次数。而在实际 PCR反应中，由于引物、
RNA 模板质量等原因，扩增效率常常达不到 1，其实际产物量应为 X＝X0（1＋Ex）n。其中
扩增效率Ex 一般介于0.8至1之间[9]。 作为对PCR 技术的一种补充，实时荧光定量PCR技术不仅实现了对 DNA 模板的定量检
测，而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应、能实现多
重反应、自动化程度高、无污染性等特点 [10]。 实时荧光定量 PCR 常用模式有两种：第一种为荧光杂交探针，如 5’核酸酶水解探针
(TaqMan)、分子信标(Molecular beacons)等，均基于能量共振转移的原理；第二种为双链 DNA
特异结合染料，如 SYBR Green 域BEBO，结合于双链 DNA微槽(MGB)，结合后可显著增强
荧光强度[11，12]。 近年来，随着 PCR 技术的不断发展，检测血清中游离 DNA 已得到了更广泛的应用：J.
Weiss 等[13]采用实时 TaqMan PCR检测不同基因型HBV阳性患者的血清样本，均得到了较准确的特征性结果，为临床诊断提供了可靠依据；姚思敏等 使用实时荧光定量 PCR 法检测
HBV阳性患者血清中的共价闭合环状 DNA(cccDNA)，发现抗病毒治疗对血清 HBV cccDNA
有抑制作用；即说明，血清 HBV cccDNA 可作为抗病毒治疗的重要监测指标；Yanfeng Wu
等[15]以实时荧光定量 PCR技术对肺癌患者的血清样本进行检测，也获得了相关度较好的、可应用于临床筛查的的检测结果。
1.3 microRNA 的定量分析技术
非编码小 RNA（microRNA，miRNA）是广泛存在于真核生物中的一类内源性非蛋白质
编码的单链小 RNA分子，长约20～25 个核苷酸，具有高度保守性，通过其 5'端与靶 mRNA
分子的3'端非翻译区域（3' - untranslated regions, 3 ‘ -UTR)完全或不完全的互补配对结合，识
别特定的目标 mRNA，并诱导其降解或抑制蛋白翻译，进而在基因转录后调控中发挥重要作
用，参与生物多种信号通路调节[16]。目前已确认人类基因组中的 miRNA 约有 500 种,其中至
少有200多种 miRNA 序列与肿瘤密切相关。
多项实验证实，miRNA 能够游离于细胞之外，存在于外周血中，且从血浆中提取的绝大
多数 RNA 为 miRNA。这类能在体液或外周血中稳定存在并且可被检测到的 miRNAs 又被称
为循环 miRNA。近年来的深入实验表明， 与其他RNA分子易降解的性质不同，成熟的 miRNA
分子具有特殊的核酸蛋白质结合形式，并且部分 miRNA 分子可形成微小囊泡在细胞间传递，
有极好的环境耐受性。因此，miRNA在血浆、血清中的稳定性非常好，经历多次反复冻融、
24h室温放置、强酸、强碱、福尔马林浸泡、DNA酶、RNA酶等恶劣情况下仍不被降解，并
保持有血液含量的相对稳定。另外， miRNA在血清和血浆中的表达不存在差异；外周血miRNA
的表达亦不存在明显的性别、个体差异[16，17]
。因此，可通过提取血清或血浆来检测 miRNA，
且无论新鲜血液或-80℃冻存的血液皆可作为取样来源。
血液 miRNA 除具有耐受环境性好，存在稳定的优点外，还有很强的细胞、组织或疾病
特异性，是理想的疾病诊治的分子生物标志物。目前已在肿瘤、妊娠、组织损伤等领域的研