摘要：黑麦是异花授粉作物，具有很高的遗传多样性。为了解黑麦不同品种间及由其合成双倍体间的多样性，本研究首先采用 14 个黑麦染色体特异标记对荆州黑麦 14 个单株、昭通黑麦 15 个单株进行分析，14 个标记在荆州黑麦产生 11 个多态性位点，每个标记的多态性信息含量变化为0.00-0.64，平均 0.15。在昭通黑麦中产生 16 个多态性位点，每个标记的多态性信息含量变化为0.00-0.60，平均 0.20。进一步利用相同的分子标记在辉县红-荆州黑麦双倍体“荆辉 1 号”18 个单株、辉县红-昭通黑麦双倍体 16 个单株中进行了分析，在荆辉 1 号产生 5 个多态位点，每个标记的多态性信息含量变化为 0.00-0.44，平均 0.10。在辉县红-昭通黑麦双倍体产生 7 个多态位点，每个标记的多态性信息含量变化为 0.00-0.51，平均 0.17。根据分子标记分析结果分别选择荆州黑麦、昭通黑麦、荆辉 1 号、辉县红-昭通黑麦双倍体各 1 个单株，对其自交后代中的 1 个单株进行 FISH分析，核型分析结果显示，在 1R 和 7R 染色体上均存在多态。27431
毕业论文关键词：黑麦属；染色体特异标记；荧光原位杂交；遗传多样性
Genetic Diversity Analysis of Secale cereale and Its Amphiploid
Abstract：Rye is a cross-pollination crop with high genetic persity. In order to understand the persitybetween the different varieties of rye and amphiploids synthesized with wheat, a set of 14 EST primersspecific for 7 rye chromosomes were firstly used to investigate the genetic persity of 2 rye cultivarsJingzhouheimai and Zhaotongheimai. A total of 11 polymorphic loci were produced in jingzhouheimai. ThePIC value ranged from 0.00 to 0.64 with an average at 0.15 per primer. 16 polymorphic loci were producedin zhaotongheimai. The PIC value ranged from 0.00 to 0.60 with an average at 0.20 per primer. Theseprimers were further used to analyze two amphiploids between wheat and rye, and a total of 5 polymorphicloci were produced in jinghui1hao. The PIC value ranged from 0.00 to 0.44 with an average at 0.10 perprimer. 7 polymorphic loci were produced in huixianhong-zhaotongheimai. The PIC value ranged from0.00 to 0.51 with an average at 0.17 per primer.We select one plant each material according to the markeranalysis results, and conducted FISH analysis using pSc119.2-1, (AAC)10, and rye genomic DNA as probesin one of their selfing progenies, Chromosome polymorphisms was found both in Chromosome 1R and 7R .Key words: Secale L.; chromosome specific markers; FISH; Genetic persity
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.2SSR标记分析2
1.2.1DNA提取3
1.2.2PCR扩增2
1.2.3扩增产物电泳3
1.2.4结果分析3
1.3荧光原位杂交3
1.3.1根尖细胞染色体3
1.3.1探针制备3
1.3.2原位杂交3
1.3.3染色、镜检与分析3
2结果与分析3
2.1分子标记分析4
2.1.1黑麦遗传多样性分析4
2.1.2双倍体遗传多样性分析6
2.2荧光原位杂交分析7
2.2.1黑麦的FISH分析7
2.2.2双倍体的FISH分析8
3讨论8
致谢9
参考文献9
黑麦 （Secale cereale） 属于禾本科小麦族小麦亚族 （Triticinae） ， 染色体数 2n=2X=14，染色体组RR。由于黑麦属部分物种有异花授粉的特点，黑麦属不同物种间，同一物种不同亚种以及不同材料间存在着丰富的遗传多样性。黑麦作为小麦近缘种属之一，蕴含着丰富的白粉病、叶锈病、条锈病和秆锈病等抗性基因，是小麦改良的重要基因资源，将黑麦抗病基因导入到小麦中，可以增强小麦抗性并改良小麦品质，对实现小麦的高抗高产具有重要的现实意义。例如，黑麦的 1R 染色体短臂取代小麦 1B 染色体短臂形成的小麦-黑麦 T1BL•1RS 易位系小麦品种，具有黑麦 1RS 片段上携带的抗叶锈、秆锈、条锈和白粉病的抗性基因 Lr26、Sr31、Yr9、Pm8 和大量抗逆基因[1]。除了 1RS 染色体臂，在黑麦 2R 和 6R 染色体上也存在着白粉病抗性基因，但这些基因在小麦育种方案中仍未得到有效利用，说明黑麦属可能还蕴藏着丰富的抗性基因，有深入挖掘的巨大潜力。此外，奥地利黑麦、荆州黑麦、及多种优尔倍体、八倍体小黑麦中也都含有较多抗性基因[2]。南京农业大学细胞遗传研究所利用发现于我国湖北省荆州地区襄河两岸沙丘及滩地的一种栽培黑麦荆州黑麦同普通小麦品种辉县红进行杂交获得其双二倍体。荆州黑麦（Secale cereale cv. Jingzhouheimai）不仅抗多种麦类病害、耐瘠薄，而且易于与普通小麦杂交，并已有培育成功的小麦品种（系）的报道[3]。通过多年鉴定发现辉县红-荆州黑麦双二倍体具有高抗小麦白粉病、梭条花叶病等多种病害[4]。因此，研究黑麦的遗传多样性是小麦育种中一项很重要的工作随着分子生物学技术的发展，分子标记种类及检测手段日趋完善，微卫星亦称简单序列重复（simple sequence repeats，SSR）具有多态性高、数量丰富、重复性好、呈共显性、且广泛分布于基因组等优点[5-8]，为遗传图谱构建、目标性状基因定位、遗传多样性分析和基因图位克隆等研究奠定了良好的基础。国内外有过诸多利用 SSR 标记进行黑麦遗传多样性研究的相关报道。 Bolibok-Brgoszewska et al.利用已经报道过的22对SSR引物对 367 份黑麦材料进行遗传多样性分析，结果发现同从欧洲育种公司直接收到的黑麦材料相比，黑麦基因库中的材料具有更高的遗传多样性，表明黑麦的遗传多样性在育种过程中正在逐渐变窄[9]。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术是20世纪80年代末在已有放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传学研究技术,具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点。目前已被广泛应用于细胞遗传学、基因定位、基因作图、基因扩增、转基因鉴定、染色体结构和功能研究、物种间亲缘关系及物种进化研究等领域[10]。细胞原位杂交技术的应用丰富了染色体水平上的遗传多样性， 安调过[11]等对390份小麦-黑麦种质材料进行GISH与FISH分析，发现在8 份农艺性状优良的代表性材料 3 份优尔倍体小黑麦与 2份八倍体小黑麦所含的黑麦染色体不完全相同。八倍体小黑麦中有 1 对来源于黑麦的小染色体，而优尔倍体小黑麦中没有类似小染色体，并且，不同材料中黑麦 4R 染色体端部的 GISH 杂交带有明显差异。本实验室也曾采用黑麦基因组专化重复序列 pSc119.2、45srDNA 和 SSR 探针对来源于我国和国外的 5 个栽培黑麦品种进行了分析，也发现其在染色体水平上的多态性（未发表资料）。目前对黑麦遗传多样性的研究更多的是集中在分子遗传学或者细胞遗传学水平，并且很少有人对黑麦和小麦杂交获得的双二倍体的遗传多样性进行分析，本研究综合利用分子标记分析、多种探针结合进行的 FISH 核型分析和农艺性状分析了解两个黑麦品种及其合成的双倍体的遗传多样性，不仅可以了解黑麦本身的遗传多样性，还可以了解双倍体中黑麦染色体的遗传多样性。1 材料与方法1. 1 实验材料荆州黑麦 14 个单株、 昭通黑麦 15 个单株、 辉县红-荆州黑麦双二倍体“荆辉 1 号” 18个单株、辉县红-昭通黑麦双二倍体16 个单株，以及这些单株的自交后代。所有材料均由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室提供。1. 2 SSR 标记分析1. 2. 1分子标记 本研究选用14个黑麦染色体特异标记， 每条染色体2个标记 （表1） 。1. 2. 2 DNA 提取 供试品种总 DNA 提取采取 CTAB 大量提取法，具体步骤按照CIMMYT（International Maize and Wheat Improvement Center）实验操作流程[13]。DNA质量和浓度用 NanoDrop 2000（Thermo Scientific）紫外分光光度计进行测定，根据测量值调节工作液浓度。1. 2. 3 PCR扩增 PCR反应体系为 10 μl：包含 0.1 μl（0.5 U）Taq 酶，0.2 μl dNTPs，1 μl 引物，1 μl 10×PCR 缓冲液，1 μl（25 ng/ml）模板，剩余用水补齐。PCR反应程序：预变性 3 min，PCR 扩增 33 个循环，每循环 94 ℃变性 45 s，55℃（视引物而变）退火45 s，72℃延伸90 s，最后 72 ℃延伸 10 min。