染色体重塑在ABERRANT PANICLEORGANIZATION2（APO2）/RFL调控水稻穗发育中的功能分析
毕业关键词：水稻；染色体重塑；APO2；穗发育
The analysis of Chromatin remodeling affecting the way of APO2 regulating panicle development in Rice
Abstract：Rice is one of the most important crops in the world. Spike type has an important effect on its yield. APO2, as a homologous gene of LFY in Arabidopsis, can delay the transformation of branch meristem to flower meristem of rice and thus change the yield. Chromosome remodeling is a kind of epigenetics. SYD and BRM in SWI / SNF complex of Arabidopsis have been involved in the response of LFY to hormones. The experimental data of the yeast plasmids showed that SYD interacted with APO2. Therefore,our research is about the relationship between APO2 and SYD with constructing the mutant, and studying the function of chromosome remodeling in APO2. The results shows that there are self-activating plasmids in the plasmids of yeast two-hybrid screens, and SYD and SMC5 interacts with APO2 really. It is important to further explore and verify the function of chromosome remodeling in the control of panicle development in APO2, which is important for the regulation of rice yield.. Key words：Rice；Chromatin remodeling；APO2；Panicle development
目 录
摘要 .. 1
关键词 . 1
Abstract .. 1
Key words . 1
引言 .. 2
1 材料与方法 .. 2
1.1 试验材料 2
1.1.1Crisper Cas9 2
1.1.2突变体的筛选 .. 3
1.1.3突变体表型的观察 3
1.2酵母双杂 . 4
1.2.1酵母感受态的制备 4
1.2.2AD 质粒自激活的验证 3
1.2.3BD 质粒自激活验证 . 4
2 结果与分析 .. 4
2.1 突变体表型统计 4
2.2 与APO2互作蛋白的筛选 .. 4
2.2.1AD 质粒自激活的验证 5
2.2.2BD 质粒自激活验证 . 6
3 讨论 . 8
3.1 APO2通过染色体重塑影响穗发育 8
3.2 APO2可能通过SMC5影响叶片生长 . 9
致谢 .. 9
参考文献. 9
引言 水稻是重要的粮食作物，其产量与穗型具有密切关系。在穗部性状中，又以二次颖花对产量的影响更大，因此研究与水稻穗发育相关的基因则至关重要[1]。 在水稻中，顶端分生组织转变为花序分生组织是水稻花序发育的第一步。枝梗分生组织的生长呈现有限生长，而颖花分生组织则是无限生长，因此为提高水稻产量则需要延迟水稻枝梗分生组织向颖花分生组织的转化。水稻开花延迟的最典型特征是不能产生或不能及时产生花序分生组织[2]。在拟南芥中，LFY 具有文持花分生组织正常功能的作用。前人研究发现，LFY 在水稻中的同源基因RFL（APO2）也具有影响水稻穗发育的功能，但其功能与 LFY 则不尽相同。研究显示 apo2 突变体在营养期花期缩短，开花延迟，花器官异常以及花分生组织的缺失。值得注意的是，水稻 apo2 突变体的花序分生组织提前转变为小穗分生组织，而拟南芥 lfy 突变体从花序分生组织向小穗分生组织的转变却被延迟。因此，这也说明了在水稻（单子叶植物）和拟南芥之间控制花序结构的遗传机制是存在差异的[3]。 染色体重塑是指导致染色质结构发生变化的一般过程，是表观遗传学的一种。它包括依赖于能量供给的组蛋白置换作用的机制。依赖 ATP 的染色体重塑复合体执行染色体重塑过程是利用 ATP 水解提供的能量来完成重塑过程。拟南芥中 SWI/SNF 复合体则是具有 ATP酶的复合体，其中核心组分包括四个核心酶：SYD (SPLAYED)、BRM (BRAHMA)、CHR12 (MINUSCULE1,MINU1)和CHR23 (MINUSCULE2,MINU2)[4-5]。 在拟南芥中染色体重塑研究较多的是 SYD 与 BRM。敲除 SYD 突变体的表型表现为植株矮小、生长缓慢、叶片变小并卷曲、雌性不育，因此其功能与干细胞文持、叶和花器官形态建成和基因转录调控、雌蕊发育相关。而敲除BRAHMA 的突变体表现为植株矮小，叶片下卷，雄性不育，其功能则与干细胞文持和雄蕊发育、开花时间调控、叶和花器官形态建成通过细胞分裂素信号通路调控、叶片成熟相关[5]。 众所周知，花器官是由不同的基因家族进行调控。在不同基因家族中，B 类和 C 类至关重要，因为他们调控着植物的雌性及雄性生殖器官的发育。诱导拟南芥中 B 类基因APETALA3（AP3）和C 类基因AGAMOUS（AG）的突变可以引起生殖适应性降低。研究显示，拟南芥中SWI2 / SNF2 染色质重塑ATP 酶 SPLAYED（SYD）BRAHMA（BRM）可以激活AP3和AG。他们是在花发育期间，被吸引结合到 AP3和AG的调节区，同时与 B类和C 类基因表达的直接激活因子，LEAFY（LFY）和SEPALLATA3（SEP3）产生物理互作[6]。 明确了解APO2调控水稻穗发育的机制具有重要意义。前期通过酵母双杂筛选文库发现与 APO2 存在互作的蛋白，其中包括与染色体重塑相关的 SYD 以及与解螺旋酶泛素化旋结构相关的SMC5。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1CRISPR Cas9 CRISPR/Cas 系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的 RNA 指导的降解入侵病毒或噬菌体 DNA 的适应性免疫系统。本实验是通过将目标片段转入载体，再将载体转化进入大肠杆菌。之后菌落PCR 验证，具有目标条带的菌落摇菌12h，提取质粒。质粒测序正确之后，将正确的质粒和 pCas9载体一起双酶切。双酶切产物凝胶电泳后，将目标片段进行胶回收，根据浓度确定目标片段和载体的体积比，将目标片段和载体连接。连接后转化，菌落PCR，具有目标条带的菌落摇菌 12h，提取质粒。测序后完全正确的质粒由公司进行农杆菌转化，获取幼苗。 大肠杆菌质粒的提取方法： （1）取1.5ml菌液，6000rpm 5min 离心，去上清； （2）加入试剂盒中的 Solution1 250μl涡旋；Solution2 250μl上下颠倒静置2min； Solution3 300μl上下颠倒； （3）离心 13000rpm 10min 留上清，转换至spin columns； （4）离心 13000rpm 1min； （5）加入HBC Buffer 500μl离心，13000rpm 1min； （6）加入Wash Buffer 700μl离心，13000rpm 1min，弃液体； （7）重复（6）； （8）空管离心13000rpm 3min； （9）加入40μl水溶解DNA，37℃静置5min；离心 1000rpm 3min； 1.1.2突变体的筛选 通过酵母双杂筛选文库中与 APO2 存在互作的蛋白，其中包括SYD、OTLD1、OsAE7、OsDUF59 以及 SMC5，依次编号为 iRFL8、iRFL10、iRFL11、iRFL12。利用我们构建完成的Crisper 载体，交由公司通过愈伤组织的培养获得 iRFL8、iRFL10、iRFL11、iRFL12的突变体植株即T0 代。将其均种植在水培叶中，采用长日照处理即日照 16h，白天温度为 28℃，夜间温度24℃。在其约四叶期时即 2016 年 9 月 15 日开始剪取约 3cm叶片，采用氯仿法提取DNA，再通过PCR扩增跑胶。 PCR酶采用Takara公司的Ex Taq Premix，变性温度为94℃，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min。跑胶采用琼脂糖跑胶，若有清晰明亮的条带则送公司进行测序。杂合及纯合突变体则移栽至培养土中，并搬到牌楼（光照更为充足）进行生长，2016年10月20日完成全部测序及移栽。 以上为T0 代筛选。在 T0代穗成熟之后收种，由于抽穗时间不一样，2016年12 月 30日进行第一批浸种，1月 3号播种，之后分别在2017年2月8 号和18 号进行第二批和第三批播种。在T1代四叶期开始采用与T0代一样的方法提取DNA。 PCR 则先进行潮霉素筛选，潮霉素筛选均为两次重复，确保没有潮霉素抗性的情况下进行PCR Ex Taq 扩增测序。